病變紅細(xì)胞的原子力顯微鏡顯微觀察測(cè)試

郭志峰

(神華準(zhǔn)能資源綜合開發(fā)有限公司 研發(fā)中心，內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 010300)

人體血液中主要的細(xì)胞為紅細(xì)胞，因此紅細(xì)胞的形態(tài)對(duì)血液維持人體正常的生理機(jī)能有著非常重要的影響[1]。血液中紅細(xì)胞的形態(tài)特征及其體積、容積等細(xì)胞病理變化是對(duì)某些疾病診斷和研究的重要依據(jù)[2,3]。正常紅細(xì)胞的形態(tài)為中央凹陷的圓盤狀，邊緣較厚，直徑約5～8μm，細(xì)胞膜表面呈光滑狀。在病理狀況下，紅細(xì)胞的顯微形態(tài)在致病因素影響下會(huì)發(fā)生變化，如棘狀紅細(xì)胞增多癥所導(dǎo)致的紅細(xì)胞形狀變異為表面長滿突起的棘狀。紅細(xì)胞對(duì)其微環(huán)境的變化非常敏感，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)離子濃度，ATP和膜骨架蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化時(shí)，細(xì)胞的形態(tài)就會(huì)發(fā)生改變，當(dāng)人體受到某些疾病侵害時(shí)可導(dǎo)致紅細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，從而使其發(fā)生病理改變，因而可以通過觀察紅細(xì)胞的顯微形態(tài)為某些疾病的診斷提供重要依據(jù)[4,5]。目前，可以用于生物細(xì)胞顯微形態(tài)的觀察儀器主要有光學(xué)顯微鏡、掃描電子顯微鏡和原子力顯微鏡等。光學(xué)顯微鏡操作簡便易行，應(yīng)用范圍廣，但光學(xué)顯微鏡由于可見光波長的限制，分辨率低，不能清晰地觀察到紅細(xì)胞的顯微形態(tài)及細(xì)胞膜的表面細(xì)微狀態(tài)，因而其應(yīng)用受到了很大的限制。掃描電子顯微鏡是應(yīng)用非常廣泛的顯微形貌觀察儀器，但由于掃描電鏡主要適合于觀察導(dǎo)電性良好的樣品，對(duì)于人體紅細(xì)胞這種導(dǎo)電性非常差的樣品來說，即使對(duì)其進(jìn)行噴金鍍膜處理后，其觀察效果也非常不好，同時(shí)由于掃描電鏡不能測(cè)量紅細(xì)胞表面的粗糙度數(shù)據(jù)，因而其不能對(duì)紅細(xì)胞膜表面的平整度進(jìn)行評(píng)價(jià)。原子力顯微鏡(AFM)是通過探針與被測(cè)樣品之間的微弱相互作用力即原子力來獲得物質(zhì)表面形貌的信息。AFM能夠在真空、空氣或溶液環(huán)境中直接對(duì)生物大分子等生物材料進(jìn)行測(cè)試，獲得直觀的三維形貌和尺寸信息，并具有納米級(jí)別的分辨率；能夠在近生理的環(huán)境中對(duì)生物樣品進(jìn)行納米級(jí)測(cè)試和操縱，對(duì)其活性過程進(jìn)行跟蹤觀察[6-8]，因此在生物結(jié)構(gòu)的研究中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，目前已被廣泛應(yīng)用于多肽、DNA、核酸、蛋白質(zhì)、微生物、細(xì)胞、透明質(zhì)酸等各種生物材料顯微結(jié)構(gòu)的觀察研究[9-15]，然而其專門用于人體血液中紅細(xì)胞顯微形態(tài)的測(cè)試研究方面的報(bào)道還非常少。本文專門采用AFM分別對(duì)人體正常和各種病變的紅細(xì)胞顯微形態(tài)進(jìn)行了對(duì)比測(cè)試研究，以期為因紅細(xì)胞變異所導(dǎo)致的人體某些疾病的快速診斷提供可靠的依據(jù)。

1 樣品制備方法與儀器測(cè)試條件

1.1 樣品制備方法

實(shí)驗(yàn)所需血樣均由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科提供,分別取自新鮮抗凝正常人體血液和棘形紅細(xì)胞、口形紅細(xì)胞、靶形紅細(xì)胞增多癥等病變血液各1.0mL，按1:1比例直接滴入等量的固定液(4%多聚甲醛-2.5%戊二醛),4℃固定1h，然后低速離心5min,棄去上清液，用0.1mol/L磷酸緩沖液漂洗并重新離心去上清液3次，而后依次用50%、70%、90%的無水乙醇梯度脫水，吹散后，用滴管取含有紅細(xì)胞的乙醇溶液滴在預(yù)先處理好的蓋玻片上(蓋玻片上覆蓋一層Formvar膜)，氮?dú)獯蹈珊蟠郎y(cè)。

1.2 儀器與測(cè)試條件

原子力顯微鏡測(cè)試采用德國布魯克公司生產(chǎn)的Dimension Edge型原子力顯微鏡，測(cè)試采用輕敲模式，在空氣環(huán)境中進(jìn)行測(cè)試，探針采用針尖曲率半徑為8nm，力常數(shù)為40N/m，共振頻率為331.179kHz的硅探針，掃描范圍分別為20×20μm、10×10μm、1×1μm，掃描頻率為0.5Hz。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 原子力顯微鏡對(duì)正常紅細(xì)胞的測(cè)試結(jié)果

圖1、圖2分別為單個(gè)和多個(gè)人體正常紅細(xì)胞的AFM顯微三維圖像，從圖中可以看到人體血液中正常的紅細(xì)胞形態(tài)均勻，呈中央雙凹的圓盤形，中央較薄，邊緣較厚，細(xì)胞膜表面光滑。圖1右側(cè)部分為通過NanoScope分析軟件在左側(cè)單個(gè)紅細(xì)胞上面沿著紅線處所拉取的截面線，從截面線數(shù)據(jù)可以得出單個(gè)人體正常紅細(xì)胞的直徑在7.8μm左右，中央凹陷部分深度在1.3μm左右。通過NanoScope分析軟件對(duì)圖2中所測(cè)到的6個(gè)正常紅細(xì)胞尺寸進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后得出其平均直徑為7.5μm，中央凹陷部分平均深度為1.5μm。通過讓探針精確定位到紅細(xì)胞膜表面進(jìn)行小范圍精細(xì)掃描可以得到紅細(xì)胞膜表面的顯微結(jié)構(gòu)三維圖(圖3)，通過NanoScope分析軟件可以得到所測(cè)區(qū)域的平均粗糙度值為3.03nm，均方根粗糙度值為3.68nm。從圖3和粗糙度數(shù)據(jù)可以看到人體正常紅細(xì)胞表面均由形態(tài)均勻的納米小顆粒組成，表面極其光滑，這與Zhang等[16]的測(cè)試結(jié)果所一致，這也可以證實(shí)此測(cè)試方法的可靠性。

圖2 多個(gè)正常紅細(xì)胞的AFM三維形貌圖

Fig.2 The 3D image of multiple normal erythrocytes

圖3 正常紅細(xì)胞細(xì)胞膜表面局部放大三維形貌圖

Fig.3 The 3D image of erythrocyte membrane surface

2.2 原子力顯微鏡對(duì)棘形紅細(xì)胞的測(cè)試結(jié)果

圖4左側(cè)部分為人體病變血液中棘形紅細(xì)胞變形初期的AFM顯微三維圖像，圖4右側(cè)部分為通過NanoScope分析軟件在左側(cè)單個(gè)紅細(xì)胞上面沿著紅線處所拉取的截面線，從圖中可以看到棘形紅細(xì)胞在變形初期其直徑大小并未發(fā)生明顯的變化，而其中央凹陷部分則在逐漸上翻，在細(xì)胞膜表面開始逐漸長出小的凸起，隨著中央凹陷部分的逐漸上翻和凸起的逐漸長大(如圖5a所示)，最后完全變?yōu)榧渭t細(xì)胞(如圖5b所示)。圖6為多個(gè)棘形紅細(xì)胞的AFM三維形貌圖，從圖中也可以看到從正常紅細(xì)胞到棘形紅細(xì)胞是一個(gè)逐步變形的過程。通過讓探針精確定位到變形初期的棘形紅細(xì)胞膜表面進(jìn)行小范圍精細(xì)掃描可以得到變形初期的棘形紅細(xì)胞膜表面的顯微結(jié)構(gòu)三維圖(圖7)，通過NanoScope分析軟件可以得到所測(cè)區(qū)域的平均粗糙度值為3.61nm，均方根粗糙度值為4.40nm。從圖7可以看到變形初期的棘形紅細(xì)胞膜表面形貌與正常紅細(xì)胞膜表面形貌有很大的不同，細(xì)胞膜表面的納米小顆粒開始膨脹變大，這也就可以從微觀角度解釋棘形紅細(xì)胞棘形凸起生成的原因，粗糙度數(shù)據(jù)也表明棘形紅細(xì)胞表面粗糙度比正常紅細(xì)胞表面粗糙度要大，從這一點(diǎn)也可以說明棘形紅細(xì)胞在變形初期其細(xì)胞膜表面的微觀結(jié)構(gòu)已經(jīng)發(fā)生了變化。通過NanoScope分析軟件得到變形中期和完全變形后的棘形紅細(xì)胞膜表面的平均粗糙度值分別為10.31nm和70.64nm，這說明隨著紅細(xì)胞的變形，其膜表面逐漸變得粗糙。紅細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)的改變表明紅細(xì)胞的生理性質(zhì)發(fā)生了改變，紅細(xì)胞的彈性和變形能力以及運(yùn)載氧的能力也肯定會(huì)受到影響。

(a)

(b)

圖5 單個(gè)棘形紅細(xì)胞變形中期(a)和完全變形后(b)的AFM三維形貌圖

Fig.5 The 3D image of single acanthocyte in the middle (a) and last (b) stage of deformation

圖6 多個(gè)棘形紅細(xì)胞的AFM三維形貌圖

Fig.6 The 3D image of multiple acanthocytes

圖7 棘形紅細(xì)胞細(xì)胞膜表面局部放大三維形貌圖

Fig.7 The 3D image of acanthocyte membrane surface

2.3 原子力顯微鏡對(duì)口形紅細(xì)胞的測(cè)試結(jié)果

圖8、圖9分別為單個(gè)和多個(gè)人體病變血液中口形紅細(xì)胞的AFM顯微三維圖像，從圖中可以看到口形紅細(xì)胞變形嚴(yán)重，分裂為多層圓環(huán)狀結(jié)構(gòu)。圖8右側(cè)部分為通過NanoScope分析軟件在左側(cè)單個(gè)紅細(xì)胞上面沿著紅線處所拉取的截面線，可以得出變異后紅細(xì)胞的直徑在9.0μm左右，中央凹陷部分深度在1.4μm左右。通過NanoScope分析軟件對(duì)圖9中所測(cè)到的4個(gè)口形紅細(xì)胞尺寸進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后得出其平均直徑為9.2μm，中央凹陷部分平均深度為1.3μm。從以上數(shù)據(jù)可以看到變異后的紅細(xì)胞其直徑稍微變大，中央凹陷部分逐漸縮小為扁口形。通過讓探針精確定位到口形紅細(xì)胞膜表面進(jìn)行小范圍精細(xì)掃描可以得到口形紅細(xì)胞膜表面的顯微結(jié)構(gòu)三維圖(圖10)，通過NanoScope分析軟件可以得到所測(cè)區(qū)域的平均粗糙度值為42.3nm，均方根粗糙度值為52.2nm。從圖10可以看到口形紅細(xì)胞膜表面微觀形貌與正常紅細(xì)胞膜表面微觀形貌完全不同，膜表面也開始分裂為小的環(huán)形結(jié)構(gòu)，這說明口形紅細(xì)胞分裂為多層圓環(huán)狀結(jié)構(gòu)是一個(gè)逐步分裂的過程，由于細(xì)胞表面的分裂造成其表面的粗糙度急劇上升。

圖9 多個(gè)口形紅細(xì)胞的AFM三維形貌圖

Fig.9 The 3D image of multiple stomatocytes

圖10 口形紅細(xì)胞細(xì)胞膜表面局部放大三維形貌圖

Fig.10 The 3D image of stomatocyte membrane surface

2.4 原子力顯微鏡對(duì)靶形紅細(xì)胞的測(cè)試結(jié)果

圖11、圖12分別為單個(gè)和多個(gè)人體病變血液中靶形紅細(xì)胞的AFM顯微三維圖像，從圖中可以看到靶形紅細(xì)胞仍呈圓盤狀，但其變形嚴(yán)重，分裂為多層圓環(huán)狀結(jié)構(gòu)，凹陷中央有圓拱形凸起，通過NanoScope分析軟件在圖11左側(cè)單個(gè)紅細(xì)胞上面沿著紅線處拉取截面線，可以得到變異后的靶形紅細(xì)胞直徑在9.7μm左右，中央凹陷部分深度在0.7μm左右。通過NanoScope分析軟件對(duì)圖12中所測(cè)到的4個(gè)正常紅細(xì)胞尺寸進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后得出其平均直徑為10.2μm，中央凹陷部分平均深度為0.5μm。從以上數(shù)據(jù)可以看到變異后的紅細(xì)胞其直徑稍微變大，中央凹陷部分逐漸上翻形成圓拱形凸起。通過讓探針精確定位到靶形紅細(xì)胞膜表面進(jìn)行小范圍精細(xì)掃描可以得到靶形紅細(xì)胞膜表面的顯微結(jié)構(gòu)三維圖(圖13)，通過NanoScope分析軟件可以得到所測(cè)區(qū)域的平均粗糙度值為11.1nm，均方根粗糙度值為13.2nm。從圖13可以看到靶形紅細(xì)胞膜表面微觀形貌與正常紅細(xì)胞膜表面微觀形貌完全不同，膜表面也開始分裂為小的環(huán)形結(jié)構(gòu)，這說明靶形紅細(xì)胞分裂為多層圓環(huán)狀結(jié)構(gòu)也是一個(gè)逐步分裂的過程，由于細(xì)胞表面的分裂造成其表面的粗糙度急劇上升。

圖12 多個(gè)靶形紅細(xì)胞的AFM三維形貌圖

Fig.12 The 3D image of multiple target erythrocytes

圖13 靶形紅細(xì)胞細(xì)胞膜表面局部放大三維形貌圖

Fig.13 The 3D image of target erythrocyte membrane surface

3 結(jié) 論

通過原子力顯微鏡對(duì)人體血液中正常紅細(xì)胞和病變紅細(xì)胞的比較測(cè)試研究發(fā)現(xiàn)，原子力顯微鏡具有非常高的分辨率。既可以用于紅細(xì)胞的整體三維形貌成像，可以清晰地觀察到正常紅細(xì)胞和病變紅細(xì)胞不同的顯微形態(tài)，并可以對(duì)正常紅細(xì)胞和病變紅細(xì)胞的整體三維尺寸進(jìn)行精確測(cè)量，這可為人體血液中紅細(xì)胞疾病的快速診斷提供可靠的依據(jù)；又可以對(duì)紅細(xì)胞細(xì)胞膜表面的顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行三維成像并測(cè)量細(xì)胞膜表面的粗糙度數(shù)據(jù)，從而為人體血液中紅細(xì)胞疾病的病理研究提供依據(jù)。與紅細(xì)胞形態(tài)改變相關(guān)的疾病包括神經(jīng)系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病、感染性疾病等部分疑難診斷的病例，當(dāng)常規(guī)檢驗(yàn)方法難以確診時(shí)，原子力顯微鏡檢查可以提供重要的病理診斷依據(jù)。該測(cè)試手段完全可以用于紅細(xì)胞形態(tài)相關(guān)的疾病的快速診斷與病理研究,還可以應(yīng)用于醫(yī)學(xué)其它類似領(lǐng)域。