左旋丁基苯酞灌胃聯合高壓氧治療后缺氧缺血性腦損傷小鼠腦組織Nogo-66、NgR、NFP表達觀察

張洋，王顯鶴

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江佳木斯 154002)

缺氧缺血性腦損傷(HIBI)是一種腦部損傷，新生兒HIBI是常見的腦病之一，羊水異常等多種因素都有可能導致分娩時新生兒的HIBI[1]。勿動蛋白-66(Nogo-66)通過與勿動蛋白-66受體(NgR)的結合抑制了中樞神經系統軸突再生，損傷了腦的神經功能，使NgR具有著檢測腦神經系統功能是否正常的作用[2,3]。神經絲蛋白(NFP)是神經軸突的主要細胞骨架，主要作用是維持軸突的正常形態和功能，是檢測神經系統軸突損傷情況的指標[4,5]。研究[6]表明，左旋丁基苯酞能有效降低缺氧缺血神經細胞的凋亡率，而高壓氧艙治療可有效提高腦組織的血氧含量，使神經元細胞的結構和功能得到修復，這為HIBI的治療提供了新思路。本研究對HIBI小鼠采用左旋丁基苯酞灌胃及高壓氧艙治療，觀察小鼠腦組織Nogo-66、NgR、NFP表達變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取SPF級的新生11 d的KM小鼠80只，雌雄不限，體質量6.97～7.45(7.21±0.24)g。采購于昆明醫科大學實驗動物中心。所有小鼠進行標準飼養，自由進食，充足光照。

1.2 主要試劑及儀器 左旋丁基苯酞(純度99%)，使用前需要植物油稀釋，稀釋10倍后配置溶劑。sABC試劑盒，DAB顯色試劑盒。大型高壓氧艙，免疫熒光分析儀動物飼料，手術器械，麻醉藥品。

1.3 HIBI模型制備及左旋丁基苯酞灌胃和高壓氧艙治療方法 選取80只小鼠，并隨機分為觀察組及對照組各40只。兩組小鼠均吸入乙醚后麻醉，以仰臥姿勢固定在手術臺上，切開頸部皮膚，結扎左側頸總動脈并縫合切口，2 h后置于5 000 mL密閉有機玻璃箱中。通入含有8%的氧氣的氮氧混合氣體，2 h后恢復正常供氧，制成HIBI模型。觀察組小鼠灌胃左旋丁基苯酞10 mg，后放入高壓氧艙治療，高壓氧艙治療需要每日早上9點將小鼠放入動物高壓氧實驗艙，使用純氧加壓到0.18 MPa(1.8ATA)，再慢慢減壓，用純氧洗艙3次后，加壓到0.25 MPa(2.5ATA)，吸氧60 min，經20 min勻速減壓出艙，1次/d。對照組小鼠在制模成功后不進行特殊處理。

1.4 小鼠腦組織Nogo-66、NgR檢測方法 在制模后第1、3、5、7、10天每組分別取8只小鼠，采用注射10%水合氯醛將小鼠過量麻醉后，使用室溫生理鹽水和4 ℃的4%的多聚甲醛進行心臟灌流。完成后打開小鼠的顱腔并取出大腦，選用薄刀片切下1 mm左右的腦組織，操作后將腦組織切片放到3%的戊二醛溶液中進行固定。取出腦組織后用磷酸鹽緩慢沖洗3次，沖洗結束后將腦組織切片放入四氧化鋨固定2 h；脫水后使用包埋劑進行包埋聚合，并且運用硝酸鉛與醋酸鈾染色后制成切片。在普通顯微鏡下觀察切片，利用熒光顯微鏡成像攝片，根據免疫組織熒光組織化學顯示，觀察神經元上Nogo-66及NgR綠色熒光面積及表達水平，使用ImageJ軟件將結果量化。結果以積分光密度(IOD)表示，IOD值越高表明綠色熒光面積越大，Nogo-66及NgR表達水平越高。

1.5 小鼠腦組織NFP檢測方法 采用鏈霉親和素-過氧化物酶復合物法對小鼠腦組織標本進行NFP免疫組化染色。選取小鼠腦室旁白質部位進行10×40視野攝片，用醫學圖像分析系統分析圖片，用IOD值表示陽性染色程度。結果以IOD值表示，IOD值越高表示陽性染色程度越高，說明表達陽性NFP神經元數較多。

2 結果

2.1 兩組不同時點Nogo-66、NgR IOD值比較 不同時點Nogo-66、NgR IOD值比較見表1。

表1 兩組不同時點Nogo-66、NgR IOD值比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.2 兩組NFP表達比較 觀察組及對照組NFP IOD值分別為316.794±16.389、161.032±17.084，兩組比較，P<0.05。

3 討論

HIBI是一種腦部損傷，窒息、羊水異常等多種因素都有可能導致分娩時新生兒的HIBI，臨床表現為驚厥、呼吸不規則、尖叫、拒乳等[7,8]，該病是新生兒期常見疾病及易致死致殘性疾病，部分患者可能遺留不同程度的神經系統損害癥狀，如腦癱、智力低下、癲癇、自閉癥等。目前治療手段除了維持良好通氣、有效控制驚厥及減輕腦水腫外，同時還可應用亞低溫、高壓氧等治療方法，重組人類紅細胞生成素以及干細胞治療處于臨床試驗階段。如何有效治療及減輕HIBI帶來的不良后遺癥，該問題成為一直困擾臨床醫務工作者及科學家難題，為此有關HIBI的研究，不論在臨床上還是動物實驗方面，開展相關研究非常多，而嘗試采用左旋丁基苯酞聯合高壓氧艙治療方法的相關研究非常少，所以相關研究和分析是十分必要的[9,10]。

目前，左旋丁基苯酞治療法可以明顯改變神經元生長狀態，降低了Nogo-66和NFP的表達水平[11]。高壓氧艙治療法已經被廣泛地應用到了腦外傷的治療中，為未來的研究和分析提供了科學的借鑒[12,13]。因為左旋丁基苯酞聯合高壓氧艙治療的方法加強了對神經元中Nogo-66和NgR表達的抑制作用，促進了神經元的自身恢復和功能正常，所以在未來將有更加廣泛的應用，為腦外傷的治療打下了良好的基礎。

研究發現，Nogo-66這一具有抑制活性的結構，許多研究者認為Nogo-66的存在使Nogo蛋白具有神經抑制活性的作用，使得Nogo-66成為表達神經功能是否正常的指標[14,15]。NgR是Nogo-66的一種功能性細胞表面受體，與Nogo-66結合以抑制細胞活性，損傷了中樞神經系統的功能，在研究中可以利用NgR來表達腦神經的狀態[16]。NFP是構成神經通訊網絡的基本結構，在傳遞內外信息、運輸物質及轉換能量等方面有著重要作用[17,18]。正是因為Nogo-66、NgR和NFP的表達水平反映了神經元功能的狀況，所以研究Nogo-66、NgR和NFP對分析神經系統的發病機制、臨床治療等有著重要意義。觀察組小鼠Nogo-66以及NgR表達明顯低于對照組，原因在于左旋丁基苯酞聯合高壓氧艙治療方法抑制了Nogo-66和NgR的表達。在治療后觀察組小鼠的Nogo-667和NgR表達水平明顯降低，左旋丁基苯酞和高壓氧艙的治療方式降低了神經細胞的凋亡率，使得小鼠腦內水腫減少，促進了小鼠腦內神經功能的恢復[19,20]。另外，觀察組NFP陽性表達增多且神經元數量較多，IOD值提高同時陽性染色程度增高，主要原因是左旋丁基苯酞聯合高壓氧艙治療方式抑制了神經細胞的凋亡，促進NFP發揮傳遞信號和表達信息的作用，使得NFP活性明顯提高，從而表現為IOD值顯著升高且陽性染色程度有所提高。

總之，左旋丁基苯酞灌胃聯合高壓氧治療后缺氧缺血性腦損傷小鼠腦組織Nogo-66、NgR表達下降，NFP表達升高。