氟西汀灌服對(duì)腦缺血大鼠行為學(xué)及海馬齒狀回神經(jīng)再生的影響

孫曉羽，曲慧玲

(遼寧省人民醫(yī)院，沈陽(yáng) 110015)

中風(fēng)可以導(dǎo)致偏癱、失語(yǔ)等神經(jīng)功能損傷，多發(fā)生在老年人中[1]。中風(fēng)分為腦缺血及腦梗塞，目前以腦缺血居多。盡管中風(fēng)被大量學(xué)者研究，但是有效的治療手段非常少。氟西汀為五羥色胺受體抑制劑(SSRIs)，是治療抑郁及焦慮的主要臨床用藥，目前已被廣泛的應(yīng)用于中風(fēng)后抑郁患者的治療[2,3]。研究[4～7]顯示，氟西汀可促進(jìn)海馬的神經(jīng)增生、存活、分化及突觸的重塑，可以有效地促進(jìn)中風(fēng)患者的運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。然而，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中氟西汀治療對(duì)腦缺血后海馬神經(jīng)再生情況研究甚少。本研究通過(guò)制備大鼠腦缺血模型，并給予腦缺血大鼠氟西汀治療，觀察氟西汀對(duì)腦缺血大鼠行為學(xué)及海馬齒狀回神經(jīng)再生的影響，旨在為臨床上腦缺血的治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性Wistar大鼠54只，體質(zhì)量220～250 g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑及儀器 一抗豚鼠doublecortin(DCX)(Millipore公司，美國(guó))；二抗山羊抗豚鼠488(Invitrogen公司，美國(guó))；激光共聚焦顯微鏡(FV-1000，德國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、腦缺血模型制備及氟西汀灌服 選取30只大鼠制備腦缺血模型，即采用向紋狀體及皮層注射內(nèi)皮素(ET-1)，根據(jù)Paxinos and Watson的大鼠腦解剖圖譜以前囟后+0.7 mm、矢狀線旁+2.2 mm、硬膜下-2.0 mm及前囟后+2.3 mm、矢狀線旁+2.5 mm、硬膜下-2.3 mm和前囟后+0.7 mm、矢狀線旁+3.8 mm、硬膜下5.8 mm為進(jìn)針的位置，向此三點(diǎn)注射0.5 μg/μL的ET-1溶液2.0 μL，并且在注射每個(gè)點(diǎn)位后置留5 min，防止液體倒流[8]。模型制作成功的標(biāo)志為大鼠出現(xiàn)偏癱癥狀，若大鼠無(wú)偏癱癥狀或者死亡則被剔除。30只鼠中有2只因?yàn)槁樽硭劳觯?只未出現(xiàn)偏癱癥狀被剔除，其余24只隨機(jī)分為氟西汀組和模型組各12只。另取24只大鼠，并隨機(jī)分為陽(yáng)性組和陰性組各12只，兩組不制備腦缺血模型，僅在相同的解剖注射等量生理鹽水。制模7 d后，氟西汀組和陽(yáng)性組大鼠開(kāi)始氟西汀用藥治療，即將氟西汀藥物溶解在飲水中讓大鼠自由攝取，用量為16 mg/(kg·d)[9]，持續(xù)3周。

1.4 大鼠行為學(xué)測(cè)試 氟西汀治療21 d，進(jìn)行3 d的平衡木實(shí)驗(yàn)。平衡木為一長(zhǎng)2 m，直徑2.5 cm的圓柱狀長(zhǎng)竿。大鼠在造模前進(jìn)行3 d的平衡木訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)，然后在缺血后29 d進(jìn)行平衡木測(cè)試。平衡木實(shí)驗(yàn)要用錄像記錄下來(lái)，重復(fù)3次，取平均值。患側(cè)前爪(后爪)的跌落率=患側(cè)前爪(后爪)跌落次數(shù)/總爪跌落次數(shù)。跌落在平臺(tái)下面計(jì)為完整的一個(gè)跌落，半只腳跌落在平臺(tái)下面算是半次跌落[10]。

1.5 大鼠海馬齒狀回DCX陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)及樹(shù)突總長(zhǎng)度測(cè)量 進(jìn)行3天的平衡木實(shí)驗(yàn)后處死各組大鼠，經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛350 mg/kg麻醉。暴露心臟，于心尖左緣進(jìn)針，迅速剪開(kāi)右心耳，迅速灌注100～200 mL的37 ℃生理鹽水至流出液清亮，繼之以4 ℃、4%多聚甲醛150～200 mL灌注固定；取腦組織置多聚甲醛固定液中4 ℃過(guò)夜。標(biāo)本置30%的蔗糖溶液中4 ℃保存5 d后更換蔗糖溶液繼續(xù)保存5 d。根據(jù)大鼠腦解剖圖譜[11]，包埋后取海馬水平(后囟水平2.8～4.3 mm)制作連續(xù)冠狀冰凍切片，片厚40 μm，每只大鼠共取5張切片，然后將切片凍存于-20 ℃的防凍中作免疫熒光染色備用。新生神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)志物DCX的免疫熒光染色采用漂片法[6]。先將切片用PBS洗10 min，共3次。切片置于山羊血清封閉液中孵育90 min。然后加一抗豚鼠抗DCX(1∶800)4 ℃過(guò)夜。第2天，把切片拿出來(lái)復(fù)溫30 min，然后PBS洗10 min，共3次。加二抗山羊抗豚鼠488(1∶500)室溫避光孵育2 h。用PBS洗10 min，共3次。貼片后用抗熒光淬滅封片液封片。采用激光共聚焦顯微鏡在20倍視野下觀察海馬齒狀回區(qū)域DCX陽(yáng)性細(xì)胞，NIH ImageJ圖像分析軟件計(jì)數(shù)每只大鼠每個(gè)視野的平均DCX陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)以及樹(shù)突的總長(zhǎng)度。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠前爪、后抓跌落率比較 大鼠前爪、后抓跌落率比較見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠前爪、后抓跌落率比較

注：與陰性組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

2.2 各組大鼠海馬齒狀回DCX陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、樹(shù)突總長(zhǎng)度比較 大鼠海馬齒狀回DCX陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、樹(shù)突總長(zhǎng)度比較見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠海馬齒狀回DCX陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、樹(shù)突總長(zhǎng)度比較

注：與陰性組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。

3 討論

腦中風(fēng)分為腦缺血及腦梗塞，其中以腦缺血居多，是人類(lèi)致死率和致殘率高的疾病，大多數(shù)患者會(huì)根據(jù)梗塞的大小及部位不同而遺留不同程度的感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知、行為、交流或情感功能的缺失。因此，腦中風(fēng)導(dǎo)致的神經(jīng)功能缺失不僅僅會(huì)威脅生命，還會(huì)影響存活者的生活質(zhì)量。在腦中風(fēng)3 h內(nèi)，可以用阿替普酶(t-PA)溶栓治療，但由于時(shí)間窗的限制及禁忌證等符合條件的患者少之又少。目前，機(jī)械取栓治療也是腦梗塞的一種手段，但也受時(shí)間窗的限制，且花費(fèi)較大，風(fēng)險(xiǎn)較高，一般患者難以接受。因此，積極尋找能夠使神經(jīng)細(xì)胞再生方法，從而促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)，將成為腦梗死治療的新策略。

氟西汀是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的SSRIs，廣泛用于抑郁患者的治療。氟西汀還可以用于中風(fēng)后抑郁的治療，但治療效果很局限。一些研究表明，SSRIs的預(yù)防性治療在某種疾病中可以阻止抑郁的進(jìn)展。近期研究[12]表明，SSRIs可以有效促進(jìn)中風(fēng)患者的運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。已經(jīng)有研究[13]證實(shí)，氟西汀可以使海馬齒狀回成熟神經(jīng)元的樹(shù)突增長(zhǎng)。但是氟西汀對(duì)缺血大鼠的海馬齒狀回神經(jīng)細(xì)胞的增殖情況尚不知曉。我們的實(shí)驗(yàn)是用特定標(biāo)記物DCX來(lái)標(biāo)記海馬區(qū)域的神經(jīng)細(xì)增殖情況，DCX是一種微管相關(guān)蛋白，用免疫熒光染色可以清楚地顯示神經(jīng)細(xì)胞情況，本文結(jié)果顯示經(jīng)氟西汀治療后缺血大鼠海馬齒狀回DCX陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加，同時(shí)氟西汀還可以樹(shù)突長(zhǎng)度，即表明氟西汀治療對(duì)腦缺血的神經(jīng)增殖有一定的價(jià)值，為臨床是腦梗死的治療提供一種新的手段。但是氟西汀治療對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的存活以及分化的影響尚未闡明。目前為止，氟西汀促進(jìn)海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生的機(jī)制尚不清楚[7]。在生理?xiàng)l件下或者病理?xiàng)l件下，腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(BDNF)在調(diào)節(jié)神經(jīng)增生方面起著關(guān)鍵作用[14,15]。有研究[16]表明，氟西汀不僅可以增加BDNF在正常大鼠腦中的表達(dá)，也可以增加在短暫性腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)域的表達(dá)。最近研究[17]顯示，腦缺血后SSRI類(lèi)藥物西普肽蘭的治療可以增加梗死區(qū)域BDNF的表達(dá)，并且還可以增加神經(jīng)前體細(xì)胞(NPC)增殖以及新生神經(jīng)細(xì)胞從側(cè)腦室(SVZ)遷移到梗死區(qū)域的距離。因此，氟西汀促進(jìn)腦缺血后DG區(qū)域神經(jīng)增生是由BDNF介導(dǎo)的這種機(jī)制猜測(cè)是合理的，盡管BDNF在腦缺血后氟西汀治療的大鼠腦中并沒(méi)有監(jiān)測(cè)表達(dá)情況。另外一種可能的機(jī)制是與血管內(nèi)皮細(xì)胞增生有關(guān)。有研究[18～20]表明，腦缺血后大腦修復(fù)過(guò)程中血管內(nèi)皮與神經(jīng)細(xì)胞的增生是相互協(xié)調(diào)與聯(lián)系的。在腦缺血后梗死區(qū)域新生血管內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)分泌SDF1α、MMPs或VEGF去調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞的生理活動(dòng)[21～23]。有研究證實(shí)，SSRI類(lèi)西普肽蘭在梗死區(qū)域可以顯著增加毛細(xì)血管的密度。所以，我們猜測(cè)氟西汀引起的缺血后神經(jīng)再生可能與血管內(nèi)皮細(xì)胞增生有關(guān)，但遺憾的是我們的研究沒(méi)有發(fā)現(xiàn)氟西汀對(duì)運(yùn)動(dòng)功能的影響[24～26]。也許在腦缺血的患者中，通過(guò)氟西汀的治療，他們更愿意主動(dòng)地去參與功能康復(fù)訓(xùn)練，然而在動(dòng)物的中風(fēng)模型中，這種抑郁的情緒是很少存在的，所以氟西汀對(duì)運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)并沒(méi)有改善。

總之，氟西汀對(duì)腦缺血大鼠行為學(xué)沒(méi)有影響，但能促進(jìn)大鼠神經(jīng)再生。