大黃素灌胃對原發(fā)性高血壓大鼠心臟功能的改善作用及其機制

周廣海，岳華，吳博，金松南，文今福

(山東第一醫(yī)科大學，山東泰安 271000)

高血壓是指以體循環(huán)動脈血壓升高為主要特征，可伴有心、腦、腎等器官的功能或器質性損害的臨床綜合征，是臨床常見病、多發(fā)病。雖然抗高血壓的藥物不斷問世，然而并沒有有效地控制其發(fā)生發(fā)展趨勢，目前全球發(fā)生率仍呈現(xiàn)居高不下的態(tài)勢，患病率高達31.1%[1]。長期的高血壓可導致心肌肥厚、心律失常、心功能不全等心臟功能紊亂。因此，高血壓治療目的不僅僅在于控制血壓，更重要的是對其靶器官的保護。2016年9月～2018年7月，我們通過給原發(fā)性高血壓(SHR)大鼠灌胃大黃素，觀察大黃素對SHR大鼠心臟功能的改善作用，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 大黃素購自西安嘉天生物科技有限公司，抗B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)抗體和抗Bcl-2相關的X蛋白(Bax)抗體購自Cell Signaling Technology，抗含胱冬肽酶富集功能域的凋亡抑制因子(ARC)抗體購自Santa Cruz，反轉錄和qPCR試劑購自北京全式金生物，PCR引物由上海生工合成。BL-420S型生物機能實驗系統(tǒng)(四川泰盟科技)，Western blot設備(君意)，Rotor-Gene Q實時定量PCR儀(Qiagen)。

1.2 實驗動物、分組及大黃素灌胃 SHR(收縮壓≥140 mmHg或舒張壓≥90 mmHg)大鼠10只，WKY大鼠5只，均為雄性，8～10周齡，體質量200～230 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物的使用遵守山東第一醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會要求。10只SHR大鼠分為A、B組各5只，5只WKY大鼠設定為C組，A組每天灌胃30 mg/kg的大黃素，其余兩組灌胃大黃素溶劑—1%羧甲基纖維素鈉溶液，維持10周。

1.3 大鼠血流動力學相關指標觀察 大鼠灌胃10周后，停藥1 d，腹腔注射1 g/kg烏拉坦麻醉，做頸動脈插管，連接壓力換能器，利用BL-420S型生物機能實驗系統(tǒng)記錄動脈血壓(SBP、DBP)，然后插入左心室，5 min后讀取左心室功能指標(HR、LVSP、LVEDP、±dp/dtmax)。結束后處死大鼠，并留取心臟和腎臟，凍存于-80 ℃環(huán)境備用。

1.4 心臟組織ANP、BNP、NPR-A、NPR-B及腎臟組織NPR-A、NPR-B、NPR-C檢測 采用熒光定量PCR法。心臟和腎臟中總RNA提取參照試劑盒說明書操作，在反轉錄酶的作用下反轉錄成cDNA。ANP上游引物：5′-ATACAGTGCGGTGTCCAACAC-3′，下游引物：5′-AGCCCTCAGTTTGCTTTTCAAGAG-3′；BNP上游引物：5′-GCTTTGGGCAGAAGATAGACCG-3′，下游引物：5′-AGAAGAGCCGCAGGCAGAG-3′；NPR-A上游引物：5′-GGAAACGCATTGAGTTGACA-3′，下游引物：5′-TGGTGAGCGAGTACCGAAA-3′；NPR-B上游引物：5′-CTCTATGCCAAGAAGCTGTGG-3′，下游引物：5′-CCAGGCCTTCCAAGTAGAAAG-3′；NPR-C上游引物：5′-GGTGACACCATTCGGAGAATC-3′，下游引物：5′-AGCTTGCTTAGCTTCAAAGTCG-3′；GAPDH上游引物：5′-ATGGGAAGCTGGTCATCAACG-3′，下游引物：5′-GTGGTTCACACCCATCACAAAC-3′。qPCR反應體系中分別加入cDNA模板、目的基因和內(nèi)參基因的上下游引物、SYBR Green混合溶液和水，總體積為20 μL/管，用實時定量PCR儀實時監(jiān)測熒光強度，以2-ΔΔCt計算目的基因相對表達量。

1.5 心臟組織bcl-2、bax、ARC蛋白檢測 采用Western blotting法。取出心臟，按照每10 mg組織后加入100 μL組織裂解液，勻漿，冰上裂解，離心后收集上清，加入上樣緩沖液，煮沸10 min，-80 ℃保存?zhèn)溆?。樣品?0 μg/孔上樣，電泳并轉膜后，脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別用anti-bcl-2、anti-bax、anti-ARC一抗孵育過夜，TBST洗膜后相應二抗室溫孵育1 h，ECL顯影，通過上海歐翔科學儀器有限公司的化學發(fā)光成像系統(tǒng)掃描，使用Image-Pro Plus軟件進行分析條帶，以平均光密度OD值×面積表示蛋白含量，將目的蛋白與內(nèi)參比值作為目的蛋白相對表達水平。

2 結果

2.1 各組血流動力學相關指標比較 血流動力學相關指標比較見表1。

2.2 各組心臟組織ANP、BNP、NPR-A、NPR-B mRNA及腎臟組織NPR-A、NPR-B、NPR-C mRNA表達比較 心臟組織ANP、BNP、NPR-A、NPR-B mRNA及腎臟組織NPR-A、NPR-B、NPR-C mRNA表達比較見表2。

表1 各組血流動力學相關指標比較

注：與C組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05。

表2 各組心臟組織ANP、BNP、NPR-A、NPR-B mRNA及腎臟組織NPR-A、NPR-B、NPR-C mRNA表達比較

注：與C組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05。

2.3 各組心臟組織bcl-2、bax、ARC蛋白表達比較 心臟組織bcl-2、bax、ARC蛋白表達比較見表3。

表3 各組心臟組織bcl-2、bax、ARC蛋白表達比較

注：與C組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05。

3 討論

高血壓是臨床常見疾病，以體循環(huán)動脈壓升高為主要表現(xiàn)，伴或不伴有多種心血管危險因素，90%以上的高血壓患者屬SHR。高血壓與冠心病、腦卒中等心腦血管疾病的發(fā)生密切相關，嚴重威脅人類身體健康。長期的高血壓可導致心臟功能紊亂，如心肌肥厚、心律失常、心功能不全等。目前，臨床上常用的降壓藥主要有利尿藥、β受體阻滯劑、鈣通道阻滯劑、血管緊張素轉換酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑等五大類。此外，中醫(yī)藥在治療高血壓方面也積累了大量經(jīng)驗，特別是在治療輕中度高血壓以及部分重度高血壓方面優(yōu)勢顯著，不僅能改善癥狀，提高生活質量，還能穩(wěn)定血壓，平穩(wěn)降壓，緩和降壓，改善危險因素，保護靶器官，使部分患者達到停藥減量目的[2]。中藥有效成分如葛根素、白藜蘆醇、丹參酮、原花青素等對于治療高血壓病心血管重塑、緩解臨床癥狀及降低并發(fā)癥上確有療效[3]。

大黃素是從大黃、虎杖和何首烏等廖科中藥材中分離得到的游離型蒽醌類化合物，其藥理作用廣泛，具有抗病毒、抗菌、抗炎、抗腫瘤等作用，也具有一定的利尿和降壓作用，對疾病的治療作用日益受到國內(nèi)外的重視。研究顯示，大黃素能抑制高糖引起的血管內(nèi)皮細胞毒性[4]，抑制高脂飼料誘導的動脈粥樣硬化的形成[5]，降低大鼠離體胸主動脈的緊張性，使血管擴張[6]。大黃素在大鼠心臟中的作用也有報道，如大黃素減弱自身免疫性心肌炎[7]，抑制腎性高血壓所致的心肌重塑[8]，或抑制糖尿病心肌病[9]。

血流動力學指標HR代表心率，心率越快，心輸出量越大，血壓越高；動脈收縮壓SBP和動脈舒張壓DBP反映外周血壓的高低，高血壓時二者經(jīng)常同時升高；左心室收縮壓LVSP、左心室舒張末壓LVEDP和左心室內(nèi)壓最大上升和下降速率±dp/dtmax是反映心肌舒縮性能的可靠指標，其中LVSP、+dp/dtmax反映心臟收縮功能，正值越大，收縮性能越強，而LVEDP、-dp/dtmax反映心臟舒張功能，負值越大，舒張性能越好。高血壓引起心臟負荷增加，心肌代償性肥厚，心肌舒縮功能增強，LVSP、LVEDP和±dp/dtmax指標數(shù)值變大，當心臟失代償即心功能不全后，舒縮功能減弱。本實驗中，SHR大鼠的HR、SBP、DBP、LVSP和±dp/dtmax都明顯高于對照大鼠，而大黃素灌胃10周后SHR大鼠HR、±dp/dtmax都顯著降低，提示大黃素能明顯降低高血壓大鼠的心率，改善左心室舒縮功能，防止心力衰竭的發(fā)生。本實驗中我們觀察到大黃素能改善SHR大鼠左心室舒縮功能，這與孔倩倩等[10]報道大黃素改善缺血/再灌注心臟左心室舒縮功能、Wu等[11]報道大黃素抑制急性心肌梗死相符合。這些提示大黃素在心血管功能紊亂中發(fā)揮保護作用。

鈉尿肽(NPs)家族中，ANP和BNP為主要的心臟循環(huán)激素[12,13]，可促進鈉尿排泄，擴張血管，抑制血管升壓素和腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)，抗心肌纖維化，進而產(chǎn)生降低血壓、保護心血管的作用。我們前期研究[14]發(fā)現(xiàn)，大黃素呈濃度依賴性地促進離體心房分泌ANP，提示大黃素可能具有保護心血管系統(tǒng)的作用。本研究顯示，SHR大鼠心肌ANP、BNP mRNA表達增加，這與Jin等[15]報道的結果一致，而大黃素干預則明顯抑制SHR大鼠心肌中兩者mRNA表達的升高。鈉尿肽的受體有三種，即NPR-A、NPR-B、NPR-C。研究發(fā)現(xiàn)，抑制NPR-A而不是NPR-B的表達能誘導H9c2心肌細胞的肥大；NPR-A缺失小鼠表現(xiàn)為高血壓和左室心肌肥大[16，17]，可見NPR-A具有抑制心肌肥大、保護心肌的作用。我們發(fā)現(xiàn)，與對照大鼠相比，SHR大鼠心臟NPR-A的表達沒有明顯變化，與林璋等[18]報道壓力超負荷性大鼠左心室NPR-A的表達呈動態(tài)變化趨勢—早期升高，晚期降低—并不一致，可能與高血壓大鼠的模型、周齡和程度有關。腎臟中NPR-A、NPR-B mRNA的水平在各組中無顯著差異，但是SHR大鼠腎臟中NPR-C mRNA水平明顯減弱，而大黃素干預則明顯升高其表達，這與Li等[19]報道的NPR-C能降低高血壓的結果一致，說明大黃素具有潛在對抗高血壓的作用。慢性高血壓會引起心肌重構，其發(fā)生發(fā)展過程中經(jīng)常伴有心肌凋亡。本研究結果表明，SHR大鼠心肌bcl-2的表達顯著降低且bax表達明顯升高，使bcl-2/bax降低，而大黃素干預則明顯抑制此種變化。ARC是一種在心臟中大量表達的抗凋亡蛋白，具有抑制心肌細胞調亡、保護心肌免受凋亡相關因子損傷的功能[20]。我們發(fā)現(xiàn)，SHR大鼠心肌ARC的表達顯著降低，大黃素干預能促使其表達升高。這提示大黃素通過增加bcl-2/bax比值和ARC的表達，抑制SHR大鼠心肌細胞的凋亡，進而能改善其心功能。我們所觀察到的大黃素抑制SHR大鼠心肌細胞凋亡相關蛋白的結果與Wu等[11]報道的大黃素通過抑制心肌細胞的死亡來防止急性心肌梗死的結果相一致。

總之，大黃素對SHR大鼠心臟功能有改善作用，其機制可能是通過調控鈉尿肽系統(tǒng)和心肌細胞凋亡實現(xiàn)的，提示大黃素在高血壓致心臟病變的防治方面有潛在的應用前景。