Bax、Bad基因真核表達質粒構建及轉染人胚腎細胞后的翻譯水平觀察

王孜恒，周敬偉，侯筱宇

(1徐州醫科大學，江蘇徐州 221000；2江蘇省腦病生物信息重點實驗室)

凋亡最早是由英國病理學家Kerr JF教授于1972年根據細胞形態學改變提出的概念，是指細胞在接受外界信號刺激后啟動的主動的程序性細胞死亡過程[1]。在人體內每天約有1×109個細胞發生凋亡[2]。細胞凋亡涉及內源性凋亡途徑和外源性凋亡途徑，內外途徑協同工作，清除體內有缺陷的細胞，使機體保持健康，而不受控制的細胞增殖會導致癌癥[3]等疾病的發生發展。重大腦疾病如缺血性腦血管病[4,5]、阿爾茨海默病[6]、帕金森病[7]等均與選擇性的神經元凋亡有關。深入研究選擇性神經元凋亡的信號傳遞及調控有助于發現潛在的治療藥物靶點。研究表明，Bcl-2家族蛋白可促進或抑制細胞凋亡，取決于它們的表達譜、定位或構象。Bax是首個發現的能夠促進細胞凋亡的蛋白質，也是目前認為細胞凋亡中最為關鍵的分子[8]，其編碼的蛋白質由192個氨基酸組成，分子量為20 kD[9]。凋亡應激時，Bax從胞質向線粒體轉移并形成寡聚體錨定在線粒體外膜上介導細胞凋亡[10]。Bad是只含有BH3結構域的促凋亡蛋白，由204個氨基酸組成，分子量為23 kD[11]。Bad能夠促使Bax釋放并向線粒體轉移，其在細胞凋亡中發揮的作用同樣不可忽視。但是Bax和Bad在選擇性神經元凋亡過程中的調控機制還有待進一步闡明。本研究通過構建Bax、Bad基因的真核表達質粒pcDNA3.1-Bax和pcDNA3.1-Bad，并觀察Bax、Bad在HEK293細胞中的表達情況，旨在為進一步研究腦疾病發生發展中Bax和Bad的亞細胞分布、線粒體轉位及其調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 真核表達載體、菌株和細胞株 真核表達載體pcDNA3.1為本實驗室保存，大腸桿菌DH5α感受態細胞購買于博邁德生物，人胚腎細胞(HEK293細胞)為本實驗室保存。

1.2 主要試劑 TRIzol Reagent購自Ambion公司;PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit、QuickCutTMEcoR I、QuickCutTMKpn I、QuickCutTMXho I、T4 DNA Ligase及DNA Marker購自Takara公司；LB AGAR及LB BROTH BASE購自Invitrogen公司；SanPrep 柱式質粒DNA小量抽提試劑盒及SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒購自Sango Biotech公司；Agarose購自SunShineBio公司；PureLinkTMHiPure Plasmid Midiprep Kit購自Thermo Fisher公司；PEI購自Sigma公司；兔源Bax單克隆抗體、兔源Bad單克隆抗體及鼠源β-actin多克隆抗體購自Cell Signaling Technology公司；引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.3 Bax、Bad真核表達質粒(pcDNA3.1-Bax、pcDNA3.1-Bad)的構建 ①引物設計與合成：采用美國國家生物技術信息中心(NCBI)的DNA序列數據庫查找Bax以及Bad的cDNA序列，根據其序列和pcDNA3.1載體上的多克隆位點，依據引物設計的一般原則，使用Primer Premier 5引物設計軟件設計引物，并加上合適的限制性內切酶位點。引物委托上海生工生物工程技術服務有限公司合成，序列如下：Bax上游引物序列為5’-CGGAATTCCACGTCTGCGGGGAGTCACGTG-3’，酶切位點EcoRⅠ，下游引物序列為5’-CCGCTCGAGAAGGCAGCAGGAAGCCTCAGCC-3’，酶切位點XhoⅠ；Bad上游引物序列為5’-GGGGTACCATGGGAACCCCAAAGCAGCCCT-3’，酶切位點KpnⅠ，下游引物序列為5’-CCGCTCGAGGGGCGA-TGGGAGCGGGTAGAAT-3’，酶切位點XhoⅠ。②目的基因的擴增：采用雄性健康SD大鼠腦組織為材料，使用RNA抽提試劑盒提取大鼠腦組織總RNA。使用目的基因特異性上下游引物進行RT-PCR擴增，擴增產物使用瓊脂糖凝膠電泳鑒定。③真核表達載體的構建：擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳進行膠回收，回收純化產物使用特異性限制內切酶進行雙酶切后連接至pcDNA3.1表達載體，篩選陽性真核表達質粒并進行雙酶切電泳鑒定。取10 μL質粒送南京金斯瑞生物科技有限公司測序驗證。

1.4 質粒轉染至人胚腎細胞后Bax、Bad表達觀察 ①HEK293細胞的培養和pcDNA3.1-Bax、pcDNA3.1-Bad轉染：HEK293細胞在37 ℃含5%CO2的溫箱中培養，培養基使用含10%小牛血清的高糖DMEM培養基。將真核表達質粒和脂質體分別稀釋于適量培養基中，靜置5 min后將真核表達質粒與脂質體均勻混合，室溫放置20 min，等待時將細胞培養基更換為不含血清的培養基，20 min后將真核表達質粒脂質體混合物逐滴加入細胞培養基中，4 h后更換含10%小牛血清的高糖DMEM培養基，24 h后收集細胞。②免疫印跡分析：將細胞超聲破碎后按改良Lowry法測定細胞蛋白總量，取相同蛋白量的細胞樣品經15%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，電轉移至硝酸纖維素膜上。將膜置于封閉液(3%BSA)中室溫孵育3 h，一抗工作液(Bax為1∶1 000；Bad為1∶10 000)中4 ℃孵育過夜，洗滌緩沖液洗膜5 min×3次，加入二抗工作液(1∶10 000)，室溫孵育1 h，洗滌緩沖液洗膜5 min×6次，曝光，掃描膜上顯色條帶。

2 結果

2.1 pcDNA3.1-Bax、pcDNA3.1-Bad的鑒定 瓊脂糖凝膠電泳結果顯示RT-PCR擴增出的cDNA序列大小和Bax(680 bp)、Bad(660 bp)基因片段大小一致，見圖1；培養的單菌落提取質粒后進行雙酶切電泳鑒定，酶切產物和目的基因大小一致，見圖2；南京金斯瑞生物科技有限公司測序結果與NCBI的DNA序列數據庫中Bax、Bad的cDNA序列完全一致。上述結果表明pcDNA3.1-Bax、pcDNA3.1-Bad真核表達質粒構建成功。

注：A:Bax 680 bp；B：Bad 660 bp。

注：A:pcDNA3.1-Bax；B：pcDNA3.1-Bad。

2.2 HEK293細胞中Bax、Bad表達水平 轉染pcDNA3.1-Bax真核表達質粒組在相對分子質量約20 kD處檢測到Bax過表達條帶，轉染pcDNA3.1-Bad真核表達質粒組在相對分子質量約23 kD處檢測到Bad過表達條帶(Bad上方條帶可能為其修飾條帶)，見圖3。結果表明pcDNA3.1-Bax、pcDNA3.1-Bad真核表達質粒在HEK293細胞中成功過表達。

注：A:Bax;B:Bad。

3 討論

目前認為在細胞凋亡中Bax是最為重要的分子，在線粒體凋亡途徑中發揮非常關鍵的作用。在正常生理狀態下，Bax在胞質和線粒體外膜上動態轉移，處于平衡狀態[12]，而在應激條件下，Bax從胞質向線粒體轉移后并不能再次回到胞質，而是錨定在線粒體外膜形成寡聚體，介導凋亡的發生發展[13]。Bax是首個發現能夠和Bcl-2蛋白直接相互作用的蛋白，兩者之間能夠形成異源二聚體進而起到共同調節細胞凋亡的作用[14]。在生理狀態下，細胞內的Bcl-2蛋白能夠和Bax蛋白結合，將Bax穩定在胞質中，起到抑制細胞凋亡的作用。當細胞遭遇外界或者內部應激時，Bax在Bad等促凋亡蛋白作用下，和Bcl-2或其他抗凋亡蛋白解離，Bax向線粒體轉移并錨定在線粒體外膜上，進而形成寡聚體促使線粒體通透性增加，釋放細胞色素C，進而啟動凋亡程序[15]。因此有研究認為Bcl-2和Bax之間的動態平衡對細胞的存活尤其重要。Bad能夠發揮促凋亡作用主要依賴于促凋亡蛋白最重要的功能區即BH3結構域，目前所報道的包含BH3結構域的蛋白均為促凋亡蛋白家族成員，并且都可以通過和凋亡抑制蛋白相互作用進而發揮促凋亡功能[16]。目前是否存在Bcl-2家族以外的蛋白調節Bax在胞質和線粒體之間的轉移進而調控內源性凋亡途徑我們不得而知，在這個過程中Bad又扮演著怎樣的角色還尚不清楚，均有待于進一步探究。

缺血性腦卒中是多因素、多細胞介導的病理損傷過程，其損傷機制非常復雜，迄今為止醫學上仍無法完全闡明[17]。目前國際上對于缺血性腦卒中公認的治療方案是盡早恢復或重建血流再灌注[18]，但再灌注會使神經細胞產生快速的級聯損傷反應，從而進一步加重缺血組織的病理損傷，最終導致神經細胞自身凋亡。腦缺血再灌注后會誘導蛋白表達量發生變化，其中促凋亡蛋白以及抗凋亡蛋白的改變對細胞凋亡的發生發展尤為重要，而在這其中Bcl-2家族蛋白發揮重要作用[19]。在機體正常生理狀態下，Bcl-2家族的促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白都處于細胞中某一固定的位置中。一般來說，抗凋亡蛋白主要是膜內蛋白，可以靶定在線粒體膜、細胞核膜以及內質網膜上；促凋亡蛋白一般存在于細胞質中，少數松散的黏附在線粒體表面。在凋亡刺激信號作用下，BH3結構域亞家族蛋白如Bad、tBid能與Bcl-2樣抗凋亡亞家族蛋白如Bcl-2、Bcl-xl形成的凹槽結合，置換出促凋亡蛋白Bax/Bak，后者轉位至線粒體外膜，促使線粒體膜通透性增強，介導細胞色素C的釋放，進而引發細胞凋亡[20]。目前有關腦缺血再灌注后線粒體凋亡途徑的研究主要以Bax為核心[21]，但目前關于其他家族蛋白對Bax所介導的線粒體凋亡途徑影響的研究還很少，關于其在腦缺血再灌注損傷中的機制研究更是寥寥無幾，仍需進一步深入探究。

在本研究中，我們從大鼠腦組織中提取總RNA，經RT-PCR擴增得到Bax以及Bad的cDNA序列，使用限制性內切酶進行雙酶切后與pcDNA3.1載體進行連接，酶切結果表明Bax和Bad基因序列成功插入到pcDNA3.1載體中，DNA測序及比對結果確定真核表達質粒pcDNA3.1-Bax和pcDNA3.1-Bad中的插入片段和目的基因的CDS區序列完全一致，表明真核表達質粒構建成功。將真核表達質粒轉染至HEK293細胞，蛋白免疫印跡證實真核表達質粒在真核細胞中成功過表達。Bax以及Bad真核細胞真核表達質粒的成功構建為研究Bax和Bad的亞細胞分布、線粒體轉位及其調控機制奠定基礎。對Bax以及Bad進行深入研究不僅對細胞凋亡機制的闡明有重要作用，對腦疾病的靶向治療也有重要意義。