依達拉奉腹腔注射對大鼠缺血性腦損傷的治療作用及其機制探討

曹籍文，黃云麗，陳君

(1天津市環(huán)湖醫(yī)院，天津 300350；2天津市腦血管與神經變性重點實驗室；3天津市神經病學研究所)

近年來，缺血性腦卒中的發(fā)病率居高不下，是致殘率和致死率最高的疾病之一，嚴重威脅著人類健康[1]。腦梗死發(fā)生后，會在缺血區(qū)誘發(fā)一系列復雜的病理生理過程，如腦能量代謝紊亂、氧自由基激活及級聯(lián)反應、興奮性氨基酸的毒性作用等。當缺血性腦損傷發(fā)生時，小膠質細胞最先被激活，釋放大量促炎癥因子，在神經細胞病理性損害中起重要作用。因此，盡早恢復缺血區(qū)血流供應，減少腦梗死體積，減輕炎癥因子損傷，改善神經功能缺損后遺癥狀，是早期臨床治療的關鍵，而尋找有針對性的治療藥物也成為學者們的研究熱點之一。依達拉奉是一種新型自由基清除劑，能有效延緩病情進展、改善神經癥狀、抑制神經元凋亡，廣泛應用于缺血性腦血管病的臨床治療中。Yuan等[2]證實，給予依達拉奉治療后，大腦中動脈閉塞(MCAO)大鼠缺血區(qū)小膠質細胞與IL-1β、TNF-α、iNOS等促炎性因子共表達減少，其可能通過抑制小膠質細胞活化，減輕腦神經元炎癥反應和氧化損傷，在缺血性腦損傷中發(fā)揮腦保護作用，但其分子靶點和具體作用機制目前尚不明確。Notch信號通路維持神經元和神經膠質細胞的正常生長發(fā)育，也在中樞神經系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。研究[3,4]證實，在急性腦缺血發(fā)生即刻，瞬時活化的γ-分泌酶介導Notch信號通路激活；Notch-1大量表達于活化態(tài)的小膠質細胞，主導調控其激活和炎癥因子表達；Notch信號通路參與活化小膠質細胞釋放炎癥因子，亦有可能通過調控下游NF-κB的核轉位參與缺血性腦損傷的病理生理過程[5]。但依達拉奉是否通過Notch信號通路抑制小膠質細胞的文獻報道仍少見。2018年8月～2019年1月，我們觀察了依達拉奉腹腔注射對大鼠缺血性腦損傷的治療作用，并探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 成年雄性SD大鼠36只，清潔健康8周齡，體質量180～220 g，購自中國軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心。飼養(yǎng)于無特殊病原菌環(huán)境中，自由活動、飲食飲水。所有大鼠采用隨機數(shù)字表法分為Edv組、MCAO組、Sham組各12只。

1.2 大鼠缺血性腦損傷模型制備及依達拉奉腹腔注射 ①Edv組、MCAO組：均制備缺血性腦損傷模型，即采用Longa等[6]的經典線栓法，行MCAO手術，以制備大鼠缺血性腦損傷模型。大鼠腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥，麻醉滿意后，取仰臥位固定，消毒皮膚，取頸正中切口，充分暴露右側頸總動脈和頸內外動脈。依次結扎頸總動脈近心端、頸外動脈及其分支；頸總動脈遠心端穿結扎線打活結備用，微動脈夾暫時夾閉；眼科剪在頸總動脈近分叉處剪一小口。將備好的線栓由此口插入，經分叉處沿頸內動脈入顱至大腦中動脈起始部，以阻斷大腦中動脈血流。感到輕微阻力時可停止送線，插入深度約18～21 mm，結扎線打結以防止線栓脫出，消毒并縫合皮膚。多普勒血流儀監(jiān)測大腦中動脈供血區(qū)血流量降至術前的50%以下，缺血2 h后退出線栓恢復血供。②Sham組：僅分離暴露血管不做栓塞。術中直至術后動物麻醉蘇醒均應注意保暖。Edv組于MCAO術后1 h腹腔注射8 mg/kg依達拉奉，Sham組及MCAO組分別在同時間點腹腔注射同量的生理鹽水，連續(xù)3 d。

1.3 大鼠神經功能缺損評分 造模后24 h，由兩位不明分組的實驗人員觀察大鼠，依照Longa等[6]的改良評分標準進行神經功能缺損評分：0分，正常，無明顯行為學變化；1分，不能完全伸展對側前肢；2分，能行走，輕微的向對側轉圈；3分，能行走，嚴重的向對側轉圈；4分，不能行走，向對側傾倒；5分，意識喪失，無自發(fā)活動。

1.4 大鼠腦梗死體積測算 采用氯化三苯四氮唑(TTC)染色法。造模后5 d各組分別取6只大鼠處死，迅速斷頭取腦，于-20 ℃冷凍30 min后取出。沿冠狀面切片，片厚2 mm。將腦片浸入1%TTC染液中，37 ℃水浴避光孵育30 min，期間翻動1次，使染色充分。于4%多聚甲醛中固定24 h后攝片，采用Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件分析計算腦梗死體積。采用Swanson等[7]的梗死體積間接計算法，為減少缺血后腦水腫對梗死體積的影響，以非缺血側體積與缺血側非梗死區(qū)體積兩者差值作為校正后的梗死區(qū)體積值，采用其與非缺血側體積的比值的百分數(shù)進行比較。

1.5 大鼠腦組織Notch-1、NICD、Hes-1、Iba-1蛋白檢測 采用Western blotting法。造模后5 d各組另分別取6只大鼠，以2%戊巴比妥40 mg/kg腹腔注射麻醉，仰臥位暴露心臟，注射器經左心室穿刺至主動脈，予生理鹽水灌注直至右心耳切口流出清亮液體，再取4%多聚甲醛灌注固定。迅速斷頭取腦，腦組織液氮冷凍后存于-80 ℃?zhèn)溆谩Ｈ∧X組織稱重，加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑，研磨后靜置，4 ℃下離心，取上清為總蛋白。取腦組織加入預冷的PBS 1 mL，研磨至勻漿，取上清于4 ℃下離心，棄上清，加入細胞核提取試劑，高速振蕩混勻15 s，冰上靜置，間斷振蕩，再次離心取上清液，得核蛋白。BCA法蛋白定量后保存于-80 ℃?zhèn)溆谩⒌鞍讟悠放c4×蛋白上樣緩沖液以1∶3體積混勻，100 ℃煮沸5 min，電泳、轉膜、室溫封閉，加入一抗兔抗大鼠Notch-1單克隆抗體(1∶1 000)、兔抗大鼠NICD多克隆抗體(1∶500)、兔抗大鼠Hes-1單克隆抗體(1∶500)、山羊抗大鼠Iba-1多克隆抗體(1∶1 000)、小鼠抗大鼠β-actin多克隆抗體(1∶5 000)和小鼠抗大鼠Histone-1多克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃搖床孵育過夜；洗膜，加入二抗羊抗兔IgG-HRP(1∶5 000)、羊抗小鼠IgG-HRP(1∶5 000)或兔抗羊IgG-HRP(1∶5 000)，室溫孵育1 h，ECL顯影。采用Image J圖像軟件分析條帶的光密度值，以目的蛋白灰度與內參蛋白灰度的比值代表目的蛋白的相對表達水平。

1.6 大鼠腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α檢測 采用ELISA法。取腦組織稱重，加入生理鹽水，冰上研磨勻漿，制成10%的腦組織勻漿，4 ℃下離心取上清液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩０凑誆LISA檢測試劑盒說明書操作，檢測IL-6、IL-1β、TNF-α。

2 結果

2.1 各組大鼠神經功能缺損評分及腦梗死體積比較 大鼠神經功能缺損評分及腦梗死體積比較見表1。

表1 各組大鼠神經功能缺損評分及腦梗死體積比較

注：與Sham組比較，aP<0.05；與MCAO組比較，bP<0.05。

2.2 各組腦組織Notch-1、NICD、Hes-1、Iba-1蛋白表達比較 腦組織Notch-1、NICD、Hes-1、Iba-1蛋白見表2。

表2 各組腦組織Notch-1、NICD、Hes-1、Iba-1蛋白表達比較

注：與Sham組比較，aP<0.05；與MCAO組比較，bP<0.05。

2.3 各組腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α表達比較 腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α表達比較見表3。

表3 各組腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α表達比較

注：與Sham組比較，aP<0.05；與MCAO組比較，bP<0.05。

3 討論

缺血性腦卒中是一種腦內血循環(huán)異常導致的急性缺血性腦損傷，發(fā)病率、復發(fā)率、致殘率和病死率極高，嚴重影響患者壽命和生活質量，也給家庭帶來沉重的經濟負擔。缺血性腦卒中臨床表現(xiàn)多取決于梗死灶的大小和部位，主要為局灶性的神經功能缺損癥狀和體征。目前，靜脈溶栓是臨床上公認最有效的恢復血流、搶救缺血半暗帶組織的治療措施之一[8]。然而，溶栓藥物有著嚴格的時間窗限制，且治療禁忌證眾多，因此能夠通過溶栓實現(xiàn)血管再通、改善缺血性腦損傷的仍是少數(shù)，多數(shù)患者除常規(guī)治療外，需要使用神經保護藥物。缺血性腦損傷的發(fā)生機制復雜，缺血后炎癥反應是導致神經元凋亡、神經功能受損、腦組織形態(tài)改變的重要病理過程，小膠質細胞激活在其中發(fā)揮重要的作用[9]。激活態(tài)的小膠質細胞大量釋放炎癥因子IL-6、IL-1β及TNF-α等，促進炎癥反應發(fā)生，作為中樞神經系統(tǒng)的“巨噬細胞”，吞噬病原體和細胞碎片，修復受損神經[10]；但過度活化的小膠質細胞產生細胞毒性因子，導致氧化應激級聯(lián)反應，反而加重組織損傷，破壞血腦屏障，打亂動態(tài)平衡，產生更加持久的損害[11]。

依達拉奉作為一種新型自由基清除劑和腦保護劑，被廣泛應用于缺血性腦梗死的急性期治療。盡管已經證實，依達拉奉具有明確的腦保護作用，但其具體機制尚不清楚。依達拉奉治療缺血性腦損傷的可能機制包括：①分子量小，脂溶性高，易透過血腦屏障發(fā)揮作用；②清除氧自由基，減少細胞膜損傷；抑制脂質過氧化，減少蛋白損傷變性，減小梗死灶面積；抑制線粒體凋亡通路，減少神經元凋亡；③抑制晚期糖基化終末產物，保護血管內皮細胞；調節(jié)缺血后花生四烯酸代謝，減少腦水腫；④抑制小膠質細胞活化，減少炎癥介質釋放等[12～15]。研究證實[16]依達拉奉能減少腦水腫和梗死灶體積，抑制神經元凋亡，延緩神經功能癥狀，有效改善急性腦梗死的功能結局，有益于遠期預后。本研究顯示，與Sham組比較，Edv組、MCAO組神經功能缺損評分和腦梗死體積百分比增加；與MCAO組比較，Edv組神經功能缺損評分和腦梗死體積百分比減少。提示依達拉奉對大鼠缺血性腦損傷有治療作用，其可有效改善缺血性腦損傷大鼠的神經功能癥狀，減少腦梗死體積。

Notch信號通路在γ-分泌酶作用下激活，裂解釋放出Notch-1受體胞內活性片段NICD，可不經其他信號轉導分子的作用而直接進入細胞核，調控下游靶基因Hes-1、Hes-5、NF-κB等的表達[17]。以γ-分泌酶為作用靶點可阻斷Notch信號通路，其中DAPT(GSI)是最為有效的特異性的γ-分泌酶抑制劑，被廣泛應用于實驗研究領域[18,19]。Iba-1是一種鈣結合蛋白，能與巨噬細胞和小膠質細胞發(fā)生特異性結合；當這些細胞激活后，Iba-1的表達相應上調，因此常作為反映小膠質細胞活化程度的標記物使用[20]。Cao等[21]發(fā)現(xiàn)，靜息及活化狀態(tài)的小膠質細胞均表達Notch信號通路相關分子。在生理狀況下，維持小膠質細胞處于靜息狀態(tài)，通過任何方式激活Notch通路都會導致小膠質細胞迅速活化，產生炎性介質浸潤損傷神經元；體外實驗中，用LPS處理小膠質細胞后，Notch-1受體表達上調，阻斷Notch通路則伴隨IL-6、IL-1β及TNF-α等促炎因子表達降低。在沉默Notch基因或使用γ-分泌酶抑制劑的動物模型中，腦損傷狀況和缺血后炎癥反應明顯減輕。并且在腦缺血發(fā)生早期抑制Notch信號通路，能明顯減輕炎癥損傷，更有益于組織修復；而長時間持續(xù)阻斷Notch信號通路會導致血管新生受抑制，影響神經再生。說明Notch信號通路在疾病進展的不同時期發(fā)揮著不同的作用[22]。與相對簡單的分子結構相比，Notch信號通路與其他細胞信號通路的交互作用可能相當復雜。目前在神經干細胞和腫瘤細胞研究[23]中，Notch通路與NF-κB、Wnt、TGF/BMP、TLR等通路的相互作用已經被證實。本研究顯示，與Sham組比較，Edv組、MCAO組Notch-1、NICD、Hes-1、Iba-1蛋白表達升高；與MCAO組比較，Edv組Notch-1、NICD、Hes-1、Iba-1蛋白表達降低。與Sham組比較，Edv組、MCAO組IL-6、IL-1β、TNF-α水平升高；與MCAO組比較，Edv組IL-6、IL-1β、TNF-α水平降低。提示依達拉奉對大鼠缺血性腦損傷有治療作用，其機制可能是通過下調Notch信號通路，抑制小膠質細胞活化，減少炎癥因子釋放而實現(xiàn)。

總之，依達拉奉對大鼠缺血性腦損傷有治療作用，機制可能為下調Notch信號通路、抑制小膠質細胞活化、減少炎癥因子釋放。