不同左旋聚乳酸支架微結構對心源干細胞增殖、分化的影響

鄭 輝，殷勝利，劉云奇，姜福清

支架的空間結構對干細胞增殖和分化具有重大的影響，在心源干細胞中尤為突出，與心肌的特殊功能特性密切相關，為探索空間微結構對干細胞增殖及分化的影響，本研究探求三種不同微結構：層狀結構（layered structure，LS）、球體結構（spherical structure，MS）和納米纖維結構（nanofiber structure，NS）的左旋聚乳酸（L-polylactic acid，PLLA）支架對心源干細胞增殖、分化的影響，綜合評價其效果，為組織工程材料微結構的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 標準誤差（standard deviation，SD）的雄性大鼠（8周齡）1只、三種不同微結構的PLLA支架分別56個、96孔板7個、細胞培養基（dulbecco＇s modified eagle medium，DMEM）培養液、免疫熒光染色劑、種子細胞懸浮液、顯微鏡、培養箱等。

1.2 方法

1.2.1 心源性干細胞的制備 取SD雄性大鼠（8周齡）1只，通過分離、培養、鑒定，最后得到心源性干細胞。

1.2.2 PLLA空間結構的制備 利用 PLLA制備空間結構，分別為 LS、MS、NS的支架，其截面積均為0.25 cm2，孔隙率≥94%。

1.2.3 細胞培養與實驗分組 取第三代培養的心源性干細胞（cardiac stem cells，CSCs）， 以 1×105／ml接種到7個96孔板中，每塊板選取中間24孔，分為3組，每組8孔，將消毒備用的三種材料支架置于孔中，加入 DMEM 培養液 100 μl，靜置 3～5 min后吸除孔中的DMEM培養液，隨后在各支架孔中加入制備好的種子細胞懸浮液120 μl，靜置3 min，顯微鏡下觀察。將種植好的支架放入37℃、5%CO2培養箱中培養，每隔24 h更換一次培養液，組間互為對照。

1.2.4 細胞活力檢測 采用MTT方法檢測細胞在第 24 h，48 h，72 h，96 h，120 h，144 h，168 h 的細胞活力，每組重復測量三次，取平均值。

1.2.5 激光掃描共聚焦顯微鏡檢測 取培養1周的三種微結構材料支架，給以固定、破膜、敷一抗、二抗及DAPI染色后用抗熒光淬滅封片液封膠，行激光掃描共聚焦顯微鏡檢測。……