魚類抗菌肽研究進展（二）

劉洪巖，薛暉，張世勇，王江，趙沐子，陳校輝，邊文冀

（江蘇省淡水水產研究所，江蘇 南京 210017）

3 Hepcidin

Hepcidin是一種富含半胱氨酸的多肽，最先在人源的hepcidin中發現其具有抗菌活性。此后，hepcidin在許多其他的脊椎動物被陸續發現，包括爬行類，兩棲類和魚類。在魚類中，hepcidin最先從雜交條紋鱸中發現，目前至少已經在37種魚類中鑒定到了該抗菌肽[1]。Hepcidin一般是一個由4個二硫橋形成harpin-折疊，包含8個半胱氨酸，然而魚hepcidin序列分析表明，魚類hepcidin只含有4，6或7個半胱氨酸[2]。

魚類hepcidin基因在進化過程中發生了重復和多樣化的過程中，產生了多重基因拷貝的，最多能達到八個之多[2]。Hepcidin基因由3個外顯子和內含子編碼一個信號肽，一個端功能前區和成熟肽。Hepcidin RNA轉錄的肽段大小的范圍可以從81到96個氨基酸，而成熟的hepcidin只有19～31個氨基酸，與分子量約2～3 kDa。hepcidin的等電點一般8以上，因此，hepcidin是陽離子抗菌肽。不過也有例外，如預測斜帶石斑魚的hepcidin等電點只有5.4[3]。

魚有兩種 hepcidin，hamp1和 hamp2。然而，hamp1在輻鰭魚和非輻鰭魚中都有發現，而hamp2只在輻鰭魚中有發現。此外，系統發育研究顯示hamp2存在正向選擇（但hamp1和哺乳動物中同源的基因卻不存在），這表明不同的環境中的適應性進化可能與宿主和病原體的相互作用有關。

與其他抗菌肽基因類似，魚類hepcidin可以由革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌誘導表達。此外，釀酒酵母、腫瘤細胞系如L-1210和SAF-1也可以誘導hepcidin的表達。魚類hepcidin基因也可以由病毒或聚I∶C以及有絲分裂原誘導表達。此外，環境雌激素內分泌干擾物β-雌二醇下調大口黑鱸肝臟hepcidin 亞型基因的表達[1，2，4]。

人類的hepcidin是II型急性期相關蛋白，細菌感染后的表達時序證明，hepcidin的表達高峰在發生在細菌感染后3～6 h以及腐爛發生時[5]。虹鱒感染魯爾耶爾森氏菌后，hepcidin伴隨著感染急性期反應蛋白如IL-1β，血清淀粉樣蛋白A和小腦肽的前體上調表達。因此hepcidin可以作為II型急性期蛋白，參與到魚類廣泛的先天免疫反應中。

魚hepcidin抑菌普非常廣，對于革蘭氏陽性菌和陰性菌的抑制濃度都在微米范圍內，而且對大量魚類病原菌的活性很強，例如能夠殺死帶鞭毛的金黃色葡萄球菌和假單胞菌[5]。此外，hepcidin和moronecidin能夠協同作用抑制S.iniae和小腸結腸炎耶爾森菌[6]。并且，hepcidin對多種病毒起作用，人類的Hepc25能夠誘導STAT3活化，導致抗病毒通路開啟，從而抑制HCV病毒在細胞中的復制[7]。很少有研究能夠闡明hepcidin對細菌的作用機制。在對人類的Hepc25研究中發現，與大多數抗菌肽不同，hepcidin作用于細菌時，并沒有發生膜通透性的改變，同時凝膠阻滯試驗證明，人類的Hepc25可以與DNA高效結合[8]。魚類hepcidin中也有類似的試驗結果。光發射動力學試驗表明重組hepcidin前體、合成hepcidin同樣不會引起大腸桿菌膜通透性[5]。

魚hepcidin也具有抑制癌細胞生存的能力。例如，羅非魚hepcidin TH2-3，表現出濃度依賴方式抑制人纖維肉瘤細胞株HT1080a的增殖和遷移。此外，TH2-3能夠引起HT1080細胞膜破壞，并且能夠下調c-Jun基因表達導致細胞凋亡。TH1-5能夠調節免疫相關基因的表達，并且能夠在低劑量時抑制腫瘤細胞（HeLa、HT1080 和 HepG2）生長，改變膜的結構、誘導細胞凋亡。在培養的HepG2細胞中，加入25 μM合成的Om-hepcidin或者5 μM合成的Omhepcidin前體，會導致細胞存活率下降40%，與omhep1相比，pro-omhep1具有更好的抗HepG2細胞活性[9]。

魚hepcidin能夠調節不同的免疫相關基因的表達。TH1-5轉基因的斑馬魚能夠上調IL-10、IL-21、IL-22、溶菌酶的表達；TLR-1、TLR-3 上調斑馬魚TNF-α、NF-κB等基因的表達。然而，TH2-3則起到TH1-5的拮抗作用。對多寶魚的研究已經表明，hepcidin能夠增加炎性細胞因子NF-κB的活性[10]。TH2-3也能夠在小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞中調節蛋白激酶C的表達，而且還能夠誘導細胞在形態上產生類似于PMA誘導的變化[11]。此外，在病毒引起的胰腺壞死感染的中，TH1-5調節某些干擾素和膜聯蛋白的表達。

盡管具有抗菌和免疫調節作用，hepcidin最關鍵作用是運鐵素的調節因子。運鐵素可以通過內吞作用降解，這樣能夠減少血液對鐵元素的吸收。雖然在魚類中這種作用還沒有被證實，但是hepcidin具有調節鐵元素的能力。它也可以作為其他的二價金屬的受體，如果暴露在其他二價金屬如銅和鎘，hepcidin的表達水平會上調。

4 Cathelicidins

與其他抗菌肽不同，cathelicidins成熟肽之間的同源性并不高。它們有著保守的前體肽N端區域，叫作cathelin結構域，成熟的有活性的抗菌肽由前體肽經過蛋白酶解后釋放[12]。在哺乳動物中，不僅在不同物種間，即使在同一物種中，成熟的cathelicidin序列也存在很大的變化。總的來說，所有的哺乳動物cathelicidin成熟肽是陽離子抗菌肽，具有雙親性特征，在體外具有廣譜抗菌活性。可以通過主要氨基酸序列比對發現，在C-末端有區顯著的序列相似性，具有很強的陽離子并且富含甘氨酸。

魚類中第一個cathelicidins來自大西洋盲鰻抗菌肽的分離，從編碼這些肽的cDNA序列分析，發現它們具有同源性，這與哺乳動物中cathelins是相同的。根據有無二硫鍵，魚cathelicidin分為兩種類型。研究魚cathelician發現一個高度的同源區域，這個區域似乎比哺乳動物中cathelin結構域更保守，成熟肽序列具有明顯的同源性（90%），而不同類別之間的同源性較小。此外，最近在鱈魚中發現了第三類cathelicidins，它們之間具有很高的同源性，但是與其它兩種類相比較缺乏同源性[13]。

由不同物種提純的cathelicidin，其體外抗菌活性表現出顯著的差異性。例如，鱈魚的cathelicidin對革蘭氏陰性菌具有較高活性但是對革蘭氏陽性菌幾乎不起作用，同時它還對白色念珠菌有很強的殺傷作用。與此相反，盲鰻cathelicidins對革蘭氏陰性菌和陽性菌都有很強的作用，但對白色念珠菌的作用很弱[14]。虹鱒魚cathelicidins對Y.ruckeri的作用很強，而大西洋鮭魚cathelicidins對Y.ruckeri并沒有作用[15]。成熟肽序列的差異直接導致了抗菌活性的差異，可能是由于進化過程中，對抗的病原不同而產生的進化分歧。

基于其抗菌活性，cathelicidin在體內的作用機理和表達模式基本上已經研究清楚。抗菌肽的表達一般都是應答病原刺激，如細菌和病原相關分子，而抗菌肽又能進一步調節機體免疫。重要的是，cathelicidin在早期胚胎中就發現有表達，這說明它參與機體最早期的免疫。在體外培養的鮭魚胚胎中，細菌和細菌的DNA都足以誘導cathelicidin的表達，這表明像哺乳動物一樣，魚的cathelicidin在宿主防御細菌中發揮類似的作用，但是純化的LPS并不能誘導所有魚類的cathelicidin基因表達。進一步研究發現，這與基因變異有關。大鱗鮭魚的胚胎細胞就可以被I∶C、LPS、細菌的鞭毛蛋白誘導表達，而在虹鱒巨細胞中cathelicidin可以被先天免疫反應的重要介質IL-6誘導表達。此外，細菌及其產物可以誘導鱒魚細胞系cathelicidin基因的表達[16]。體內研究進一步支持了這一假說。當香魚注射活菌后，會在鰓、肝、脾、腸等組織中，時間依賴性的表達cathelicidin[17]。此外，大西洋鮭魚和虹鱒感染Y.ruckeri后誘導抗菌肽cathelicidin的表達。大西洋鮭魚的鰓與殺鮭氣單胞菌孵育3 h之后可以產生cathe licidin，但是與鰻弧菌孵育則不能誘導cathelicidin表達。這表明抗菌肽cathelicidin在宿主防御中發揮作用的機制是復雜的[13]。

哺乳動物抗菌肽已被證明具有多種活性，其免疫和非免疫活性遠遠超過他們的體外抗菌活性。然而cathelicidin在魚類中的研究遠遠落后于這一水平。最近的一項研究表明，兩種大西洋鮭魚catheli cidins可以快速、短暫的誘導外周血白細胞表達IL-8[18]。這表明cathelicidin的免疫調節活性在哺乳動物和魚類中是相似的，這可能是一種進化上保守先天免疫調節機制。

5 魚類抗菌肽的應用價值

所有抗菌肽特點都在理論上支持其發展成為治療藥物，包括廣譜抗菌活、生化穩定性以及不產生耐藥性。魚類抗菌肽的特征更是為其應用提供了無限可能。總體來說，魚類抗菌肽和其他物種的抗菌肽對于人源的病原體作用范圍幾乎相同，但是，它們對魚類病原體更加有效，因為它們很可能與病原體一起進化。

由于很多抗菌肽在高鹽度環境中都是不穩定的，來自于海洋魚類的抗菌肽就可以補充這一缺陷。例如pleurocidin可以在300 mM NaCl環境中保持類似于其他piscidian的活性[19]。基于這種特性，pleurocidin可以被用于高鹽度的環境，如血清，眼膜高滲血癥等。除了抗菌藥物，一些魚類抗菌肽還具有體外抑制多種癌細胞的作用。

Piscidian已經被開發成多種藥物了。例如，口服或注射epinecidin-1能顯著提高斑馬魚和石斑魚感染弧菌后的生存[20]；轉染epinecidin-1的斑馬魚和石斑魚在弧菌和無乳鏈球菌感染時，肌肉顯著減少創傷[21]。此外，用epinecidin-1治療耐甲氧西林金葡菌（MRSA）感染的小鼠，能夠通過降低細菌數目增加小鼠存活率，并且增加小鼠傷口的愈合和血管的生成[22]。epinecidin-1可以用于制造滅活病毒疫苗。注射epinecidin處理過的乙型腦炎老鼠病毒（JEV）后，感染病毒時小鼠的存活率可達到100%，其性能優于福爾馬林滅活的乙腦病毒疫苗。這是因為epinecidin可以調節免疫相關基因，包括增加血清中抗JEV的抗體，從而抑制病毒在腦中的復制[18]。

魚hepcidin用于藥物處于試驗階段。其中羅非魚hepcidin TH2-3孵育過的創傷弧菌，能夠增強感染和再感染時小鼠的存活率。TH2-3的抑制創傷弧菌的效果比四環素更好，并且在血腦屏障和肝臟中，也有同樣的結果。

魚類抗菌肽作為藥物使用，阻礙其進一步發展的因素包括血清不穩定性，多肽合成費用高，以及蛋白酶不穩定性。研究者也在探索解決這些問題的方法，包括找出更小的片段，如抗菌肽的活性部位，可能會表現出更好的活性，以及與常規的抗生素連用，通過協同作用降低傳統抗生素的使用濃度，從而降低細菌抗藥性的產生。

6 總結

魚類抗菌肽在結構，基因組成和功能上都是非常多變的，也因此提供給我們一個豐富的抗菌肽庫。它們可以為更好地設計新型的治療劑提供重要信息，既可用于治療微生物感染，也可用于治療癌癥和其他病原菌感染。魚類抗菌肽的很多特點使其在水產養殖中有很大的潛在應用價值。特定的魚抗菌肽對魚類病原體有很強的活性，同時一些病原體在魚體內誘導先天免疫反應時會產生抗菌肽，這種復雜的關系表明抗菌肽機體是與病原體抗爭的產物，并且與病原體一同進化。綜上所述，抗菌肽為魚類的宿主防御提供了堅實的基礎，并且這些肽及其衍生物具有作為藥物開發的潛力。