AMPK/STAT1通路參與土木香內酯改善H2O2引起的神經細胞PC12凋亡

徐建飛，汪洋，胡旭軍，王婳，許兆軍

（中國科學院大學寧波華美醫院 重癥醫學科，浙江 寧波 315010）

由天然活性產物衍生的新型抗炎藥的發現引起了醫藥化學家的廣泛關注。土木香內酯（alantolactone，ALA）是從土木香根莖中提取的，在古代被用作中草藥。它是萜類不飽和化合物中最重要的一類，被認為是治療神經損傷、癌癥和胰島素抵抗等多種疾病的候選藥物[1-3]。最近的研究表明，ALA具有多種抗炎和抗腫瘤藥理活性[4-5]。另外，在大鼠外傷性腦損傷中，ALA表現出神經保護的作用[3]。不僅如此，ALA可保護Aβ25-35誘導的小鼠皮質神經元細胞的凋亡，并逆轉了東莨菪堿誘導的小鼠認知障礙，進一步的研究表明活性氧簇參與其中[6]。但是ALA對過度氧化應激誘導神經細胞凋亡的具體作用及其機制仍不清晰。為探討ALA抗神經細胞凋亡的作用，我們以神經細胞PC12 為對象，觀察其對H2O2引起的神經細胞PC12凋亡的抑制作用并初步探討機制，為臨床應用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料 PC12細胞購自中國科學院基礎醫學細胞中心。ALA購自上海陶素生化科技有限公司；H2O2購自美國Sigma公司；HRP標記山羊抗體兔IgG/鼠IgG購自美國Santa Cruz公司；抗GAPDH兔單克隆抗體、AMPK鼠單克隆抗體、p-AMPK鼠單克隆抗體、STAT1兔多克隆抗體和p-STAT1兔單克隆抗體購自美國CST公司；蛋白電泳、轉膜與曝光系統購自美國Bio-rad公司。

1.2 方法

1.2.1 神經細胞PC12 培養：將PC12 細胞接種到DMEM高糖培養基（含100 μ/mL鏈霉素、100 μ/mL青霉素和10%胎牛血清）中培養，每48 h換液1次，2～3 d傳代1次，傳代2次取生長良好的細胞用于實驗研究。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖情況：分別取對數生長期PC12細胞接種于96孔板中，分別加入1、5、10、20、50和100 μmol/L的ALA，在37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養24 h；分別取對數生長期PC12細胞接種于96孔板中，分別加入1、5 μmol/L的ALA提前孵育1 h后，加入H2O2處理，在37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養24 或48 h；每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），繼續培養4 h，離心后小心吸盡上清液，每孔加入150 μL DMSO吹打混勻，采用酶標儀于570 nm處讀取各孔吸光度值。按公式計算細胞增殖抑制率。

1.2.3 分組：①將PC12 細胞分組，設立正常組、H2O2（100 μmol/L）組、ALA（1、5 μmol/L）組，ALA孵育細胞1 h后再經H2O2處理24 h、48 h，分別進行MTT實驗和收集細胞進行細胞流式實驗；②將PC12細胞分組，設立對照組、H2O2（100 μmol/L）組、siAMPK組、H2O2+siAMPK組、H2O2+siAMPK+ALA（5 μmol/L）組，PC12細胞經AMPK的siRNA（10 nmol/L）處理細胞24 h后再經ALA孵育1 h，最后用H2O2處理細胞24 h，收集細胞進行Western blot實驗。

1.2.4 Western blot檢測細胞AMPK、STAT1、p-AMPK和p-STAT1的表達：細胞裂解后，測蛋白濃度并配平每個蛋白的上樣量。等量蛋白通過SDS膠進行分級分離，然后濕法轉移至PVDF膜上，相對分子質量小的用0.2 μm孔徑的膜，相對分子質量大的用0.45 μm孔徑的膜。90 min后用5%脫脂牛奶進行封閉，待封閉好后加入一抗（AMPK鼠單克隆抗體、p-AMPK鼠單克隆抗體、STAT1兔多克隆抗體、p-STAT1兔單克隆抗體和抗GAPDH兔單克隆抗體，稀釋均為1:1 000），置室溫搖床孵育2 h之后移至4 ℃搖床過夜。次日加入HRP結合的二抗（1:3 000），二抗孵育1 h后用TBST洗滌3次。加ECL液避光孵育2 min，曝光儀成像。

1.2.5 siRNA誘導的基因沉默：利用特異性siRNA序列實現細胞內的基因沉默，大鼠AMPK特異性siRNA購買自上海吉瑪制藥技術有限公司。采LipofectamineTM2 000（美國Invitrogen公司）將10 nmol/L的siRNA轉染至PC12細胞，具體操作根據說明書指示進行。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS16.0軟件進行統計分析。計量資料以表示，2 組間比較采用Student's t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析并以Bonferroni校正作后比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 低劑量ALA不影響PC12細胞增殖 不同濃度ALA（1、5、10、20、50和100 μmol/L）處理神經細胞PC12 24 h后，MTT法檢測各濃度對PC12細胞增殖的影響。實驗結果顯示20 μmol/L及以上濃度的ALA可明顯抑制PC12細胞增殖（P＜0.05），見圖1。表明高濃度ALA對PC12細胞有著細胞毒性作用，可能會影響后續研究，所以后續實驗只使用1和5 μmol/L濃度的ALA。

2.2 ALA劑量依賴性抑制H2O2引起的PC12細胞凋亡細胞MTT實驗結果顯示在H2O2（100 μmol/L）處理24或48 h條件下，與正常組比，H2O2組PC12細胞凋亡明顯上升（P＜0.01），經ALA處理后，PC12細胞凋亡得到顯著改善，且ALA濃度越高，改善效果越好，見圖2A-B。類似的結果可以在流式實驗中觀察到，見圖2C。表明ALA可緩解H2O2誘導的PC12細胞凋亡。

圖1 MTT法檢測不同濃度ALA對PC12細胞增殖的影響

2.3 ALA抑制H2O2引起的PC12細胞STAT1磷酸化

為探究ALA緩解H2O2誘導的PC12細胞凋亡的作用機制，檢測細胞凋亡密切相關蛋白STAT1的磷酸化以及細胞能量代謝調控蛋白AMPK的磷酸化情況。經H2O2處理后STAT1的磷酸化水平明顯增高，而1和5 μmol/L ALA預處理顯著降低STAT1的磷酸化（P＜0.05），并呈現劑量越高，抑制效果越明顯的趨勢（P＜0.05），見圖3A。ALA組AMPK的磷酸化水平明顯上升，并呈現劑量依賴性，見圖3B。表明AMPK/STAT1可能參與ALA緩解H2O2誘導的PC12細胞凋亡。

圖2 ALA抑制H2O2誘導的PC12細胞凋亡

2.4 ALA通過激活AMPK降低STAT1磷酸化緩解H2O2引起的PC12細胞凋亡 利用siRNA沉默AMPK的表達后，再用ALA處理，結果發現沉默AMPK后，ALA無法降低H2O2誘導的STAT1磷酸化，ALA+siAMPK+H2O2組與siAMPK+H2O2組STAT1磷酸化差異無統計學意義（P＞0.05），見圖4A-C；MTT實驗結果顯示沉默AMPK可逆轉ALA的抗凋亡作用，見圖4D。表明ALA可能通過激活AMPK降低STAT1磷酸化，從而緩解抑制H2O2誘導神經細胞PC12的凋亡。

3 討論

在腦缺血性疾病中，神經細胞凋亡是重要的病理進程。近年研究發現，在腦缺血后的幾小時內，經一系列生化級聯反應引起神經元凋亡，導致相應缺血腦區功能障礙從而引起一系列缺血癥狀，嚴重危害人類健康[7]。因此腦缺血后保護神經細胞凋亡以及尋找抗凋亡靶點成為現今抗腦缺血研究熱點。本研究發現ALA具有抗神經細胞凋亡的作用，并且發現其作用是基于對AMPK/STAT1通路的調控。

圖3 ALA對H2O2誘導PC12細胞STAT1（A）和AMPK（B）磷酸化的影響

圖4 ALA通過AMPK調控H2O2誘導PC12的STAT1磷酸化和細胞凋亡

ALA作為中藥土木香的主要成分，有研究報道其具有良好的抗腫瘤效果[4，8-9]；更有研究顯示ALA可緩解胰島素抵抗，治療外傷性神經損傷和多種炎癥性疾病[1-2，5，10]。在研究ALA對H2O2誘導神經細胞PC12凋亡的作用時，本研究首先使用了經典的細胞增殖實驗MTT實驗，檢測了不同濃度的ALA對PC12產生的毒性作用。結果發現，較低劑量時（1、5和10 μmol/L），ALA組與對照組MTT實驗結果無差異；而當濃度增加到20 μmol/L時，ALA便顯示出明顯的細胞毒性作用。因此，后續實驗選取了較低濃度的ALA（1和5 μmol/L）做進一步的研究。

AMPK是細胞發育過程中的重要調控因子，廣泛參與細胞增殖、凋亡、分化、代謝等過程[11]。STAT1被發現是AMPK調控炎癥的重要蛋白，其使得生物能量學與細胞炎癥聯系起來[12]。除此之外，JAK/STAT1作為在缺血性再灌注中起著介導心肌細胞凋亡的作用[13]；不僅如此，更多文獻報道其與細胞凋亡有著緊密聯系[14]。本研究主要探究ALA對H2O2誘導神經細胞PC12凋亡的作用。本研究采用了細胞流式和MTT的方法檢測了不同濃度ALA對H2O2誘導神經細胞PC12凋亡的影響。結果表明：與對照組比，ALA可明顯減少H2O2誘導PC12的凋亡，且呈現濃度依賴性。另外，AMPK與STAT1作為一種重要的細胞信號通路可調控細胞炎癥信號。本研究也對其進行了檢測，結果發現：與H2O2組相比，ALA可明顯增強PC12細胞AMPK的激活，同時STAT1在H2O2處理后有明顯的激活，而ALA再處理后，STAT1的磷酸化有著顯著下調，且呈現劑量依賴性。另siAMPK轉染實驗表明：siAMPK可逆轉ALA對H2O2誘導PC12細胞的p-STAT1抑制作用和抗凋亡作用，說明抑制STAT1的磷酸化的表達后ALA無法實現對STAT1的調控作用。

綜上所述，神經細胞PC12受H2O2干預后，STAT1被激活并誘導細胞凋亡，ALA處理后，可顯著激活AMPK，同時降低了H2O2誘導的STAT1的磷酸化表達和細胞凋亡。而利用轉基因技術進一步實驗發現ALA對STAT1的調控作用是通過激活AMPK實現。然而我們的研究僅在細胞層面闡明了ALA通過調控AMPK/STAT1起著神經保護作用，但未能在動物層面論證其抗凋亡作用及對認知功能障礙的保護作用。在后續研究中，我們將深入探究ALA對腦損傷的保護作用。