RETN、LEPR和ADIPOQ基因多態性與中國漢族人群2型糖尿病風險及血脂代謝的關系

鄭文文，張杭，周心禾，洪瑩，莊飛，吳宸煒，陳霞，何航輝，蘇悅，鄭超

（溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院 內分泌科，浙江 溫州 325027）

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是一種受多基因遺傳和多種環境因素影響的代謝障礙性疾病。抵抗素（resistin，RETN）、瘦素受體（leptin receptor，LEPR）和脂聯素（adiponectin，ADIPOQ）是目前發現的主要脂肪細胞因子，在肥胖、胰島素抵抗及T2DM中發揮重要作用[1-2]。本研究擬通過探討中國浙江地區漢族人群中T2DM患者與對照者之間RETN（rs1862513、rs3745367），LEPR（rs1137101、rs13306519、rs1805096）和ADIPOQ（rs1501299、rs2241766）各位點基因型和等位基因頻率分布的差異，以及RETN、LEPR和ADIPOQ基因多態性與血脂代謝的關系，為T2DM的早期預測、診斷、治療及預后提供依據。

1 對象和方法

1.1 對象 T2DM組526例，男286例，女240例，均來自2018年9月至10月溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院就診患者，診斷均符合1999年WHO糖尿病診斷和分型標準，同時排除1型糖尿病和特殊類型糖尿病；無糖尿病正常對照組344例，男189例，女155例，均來自同期在我院體檢中心體檢的健康人群，空腹血糖（fasting plasma sugar，FPG）低于6.1 mmol/L，糖化血紅蛋白（HbA1c）低于6.0%，無糖尿病家族史。所有研究對象彼此間無親緣關系。該研究獲得本院倫理委員會批準，所有入組者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 臨床及生化檢測 記錄患者年齡、性別，測量身高、體質量，計算BMI。抽取靜脈血檢測各項指標，HbA1c由高效液相色譜法測定，FPG由葡萄糖氧化酶法測定，甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）由酶法測定，高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL）用直接法測定。

1.3 基因組DNA提取及測序分型

1.3.1 提取全基因組DNA：取3 mL外周空腹靜脈血，乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）抗凝。嚴格按照DNeasy血液/組織基因組DNA提取試劑盒（美國Qiagen公司）說明書提取全基因組DNA。應用Nano-Drop-1000分光光度計（美國Thermo公司）檢測DNA濃度和純度，稀釋至約10 ng/μL后置于-20 ℃冰箱凍存備用。

1.3.2 檢測RETN、LEPR和ADIPOQ基因多態性：采用競爭性等位基因特異性PCR（kompetitive allele specific PCR，KASP）技術，自動化設計SNP分型的等位基因特異性引物和通用反向引物，引物序列見表1，由北京一道生物科技有限公司合成。具體實驗步驟如下：①DNA質檢和濃度測定：取1 μL置于百泰克ND5000超微紫外可見分光光度計測量，質檢合格后的DNA樣本方可進行后續的分型實驗，質控標準：DNA濃度＞20 ng/μL，純度OD260/OD280=1.6～2.0。②DNA均一化處理：質檢合格的DNA進行稀釋，終濃度是5 ng/μL。③PCR反應：取2 μL DNA，在55 ℃ 45 min烘干，然后配置混合物（mix），3 μL體系，需要2×KASP master mix（北京梓熙生物科技有限公司）及引物mix，mix由濃度是100 pmol/μL的F1:F2:R=1:1:2.5的比例混合，引物mix占反應體系的1/72。④參比熒光檢測：PCR反應體系配好以后，在ABI 7900熒光定量PCR儀上進行預讀，然后在ABI 9700 PCR儀再進行PCR反應，94 ℃ 5 min，94 ℃ 20 s，61 ℃ 1 min，共10個循環，降落PCR每次降落0.6 ℃；94 ℃ 20 s，55 ℃ 1 min，共26個循環；最后72 ℃ 1 min。⑤終熒光檢測：PCR完成后，在ABI 7900熒光定量PCR儀上進行后讀出，通過SDS2.4進行基因分型和判讀。

1.4 統計學處理方法 采用SPSS20.0統計軟件進行數據分析。基因型分布作Hardy-Weinberg平衡檢驗；2組等位基因頻率和基因型頻率比較采用χ2檢驗；OR 采用成組比較法（病例對照研究）比較，以95%CI 表示，采用非條件logistic回歸分析校正年齡、性別、BMI；計數資料采用χ2檢驗；計量資料中符合正態分布，采用表示，不符合正態分布，采用M（P25，P75）表示；符合正態分布的計量資料，2組間比較采用獨立樣本的t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，不符合正態分布的計量資料，采用非參數分析中的Kruskal-Wallis檢驗，采用線性回歸分析校正年齡、性別、BMI、是否使用降脂藥。P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 RETN、LEPR和ADIPOQ基因引物序列

2 結果

2.1 T2DM組與對照組臨床資料及生化指標比較T2DM組與對照組在性別、TG、HDL、LDL方面差異無統計學意義（P＞0.05）；T2DM組的年齡、使用降脂藥患者比例及BMI、FPG、HbA1c、TC水平顯著高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01），見表2。

2.2 T2DM組與對照組基因多態性分布比較

2.2.1 RETN、LEPR、ADIPOQ基因各SNP位點Hardy-Weinberg平衡檢驗：本研究共選取了RETN基因2個SNP位點，LEPR基因3個SNP位點，ADIPOQ基因2個SNP位點，分別為：rs1862513、rs3745367、rs1137101、rs13306519、rs1805096、rs1501299、rs2241766。本研究對對照組中的這3個候選基因共7個位點的基因型頻率進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，7個位點均符合Hardy-Weinberg平衡（P=0.056、0.817、0.753、0.307、0.562、0.141、0.986），表明樣本具有群體代表性。

2.2.2 RETN、LEPR、ADIPOQ基因多態性的基因型和等位基因頻率分布：RETN（rs1862513、rs3745367）、LEPR（rs1137101、rs13306519、rs1805096）和ADIPOQ（rs1501299、rs2241766）的基因型和等位基因頻率在T2DM組與對照組中的分布見表3。結果經校正年齡、性別、BMI后表明，T2DM組中RETN rs1862513基因型（GG）和變異等位基因（G）的頻率均高于對照組，差異有統計學意義（42.0% vs.30.0%，P=0.003；65.0% vs.57.1%，P=0.001，OR=1.397，95%CI=1.140～1.712）。

2.2.3 不同BMI下的RETN、LEPR、ADIPOQ基因多態性在T2DM組和對照組中的基因型頻率分布：T2DM組與對照組的RETN（rs1862513、rs3745367）、LEPR（rs1137101、rs13306519、rs1805096）和ADIPOQ（rs1501299、rs2241766）的基因型頻率分別在BMI＜25 kg/m2和BMI≥25 kg/m2中的分布見表4。結果經校正年齡、性別、BMI后表明，BMI＜25 kg/m2時，T2DM組中RETN rs1862513基因型（GG）的頻率明顯高于對照組，差異有統計學意義（42.8% vs.31.0%，P=0.015）。

2.3 RETN、LEPR、ADIPOQ基因多態性的基因型與血脂之間的關系 在總研究人群中以及不同BMI下，RETN（rs1862513、rs3745367）、LEPR（rs1137101、rs13306519、rs1805096）和ADIPOQ（rs1501299、rs2241766）的基因型與血脂之間的關系見表5。結果經校正年齡、性別、BMI以及是否使用降脂藥后表明，BMI＜25 kg/m2時，RETN rs3745367基因型與HDL水平明顯相關，差異有統計學意義（P=0.014），GG或AG基因型相較于AA基因型，HDL水平顯著降低；LEPR rs13306519基因型在BMI≥25 kg/m2時，與HDL水平顯著相關，差異有統計學意義（P=0.021），CC或CG基因型的HDL水平顯著低于GG基因型；在總研究人群中，ADIPOQ rs1501299基因型與TG水平顯著相關，差異有統計學意義（P=0.044），CC或AC基因型的TG水平顯著高于AA基因型。

表2 T2DM組與對照組的臨床特征比較

表3 RETN、LEPR、ADIPOQ基因多態性的基因型和等位基因頻率在T2DM組與對照組中的分布比較

3 討論

脂肪細胞因子是由脂肪組織分泌的生物活性分

子，包括細胞因子、生長因子、炎性因子等，可以調節脂肪組織的分化，影響葡萄糖和脂肪酸代謝。其中糖尿病相關的脂肪細胞因子是指一種與葡萄糖和血脂代謝有關的內生信號分子，可以干擾胰島素信號轉導途徑，使胰島素作用的靶組織如肝臟、肌肉以及脂肪組織產生胰島素抵抗。RETN、LEPR和ADIPOQ是主要的糖尿病相關脂肪細胞因子，在肥胖、血脂代謝、胰島素抵抗和T2DM中起著重要作用[3-14]。它們分別由RETN、LEPR、ADIPOQ基因編碼，多項研究均有發現這3種基因存在T2DM、代謝綜合征和肥胖癥的易感位點[15-18]。本研究發現在中國漢族人群中攜帶RETN rs1862513 G等位基因能顯著增加T2DM的發病風險。而BOUCHARD等[19]關于高加索人群的研究未發現RETN rs1862513與T2DM風險有相關性；MA等[20]未在高加索人群中發現該位點與T2DM風險有明顯關聯。但是，在有關亞洲人群的研究中，OSAWA等[21]研究表明在T2DM患者中RETN rs1862513的GG基因型頻率顯著增加了30%；OCHI等[22]也發現該位點的GG基因型會顯著增加年輕人的T2DM發病風險。因此，以上研究表明關于T2DM與RETN rs1862513之間的關系可能與研究對象的遺傳背景和種族差異密切相關，且RETN rs1862513增加T2DM發病風險可能在亞洲人群中更多見。進一步對BMI分層分析后發現，RETN rs1862513與低BMI的T2DM顯著相關。但現有研究表明RETN是通過胰島素抵抗來增加T2DM的發病風險[3]。這與本研究結果不同，原因可能有以下幾點：①在糖尿病的起源和胰島素抵抗中，RETN的實際生物作用仍然存在爭議，尚需進一步研究闡明；②本研究樣本量小，特別是按照BMI進行亞組分析時，導致統計效能下降，從而可能造成結果的差異性；③本研究為橫斷面研究，可能存在諸如信息偏差和選擇偏差等偏倚而導致結果的差異性。

表4 不同BMI情況下RETN、LEPR、ADIPOQ基因多態性的基因型頻率在T2DM組與對照組中的分布比較

表5 RETN、LEPR、ADIPOQ基因多態性的基因型與血脂之間的關系

RETN、LEPR和ADIPOQ這3種脂肪細胞因子在調節脂質代謝中起著重要作用[23]。本研究發現RETN rs3745367的GG或AG基因型在BMI＜25 kg/m2中具有更低的HDL水平；LEPR rs13306519的CC或CG基因型在BMI≥25 kg/m2中與較低的HDL水平明顯相關；ADIPOQ rs1501299的CC或CA基因型在總研究人群中具有更高的TG水平。ZHOU等[24]發現攜帶RETN rs34861192 G等位基因與較高的TC水平明顯相關；BECER等[25]研究表明LEPR rs1137101的GG基因型在非肥胖人群中具有更高的TC及LDL水平，在肥胖人群中則具有更高的TG水平；TURECK等[26]研究發現ADIPOQ rs1501299的TT等位基因具有更高的TC和LDL水平。本研究發現的SNPs位點與血脂的關系和以往的報道不同，補充了以往的研究。以上研究表明RETN、LEPR、ADIPOQ基因變異會影響機體的血脂代謝，可能因此導致代謝綜合征、肥胖以及糖尿病的發生，這也部分解釋了臨床上T2DM體型較胖，且多表現為腹型肥胖或內臟肥胖。

綜上所述，本研究對主要脂肪因子的相關基因多態性與T2DM以及血脂的關系進行了初步探討，發現RETN rs1862513與中國漢族人群T2DM的風險相關。RETN rs3745367、LEPR rs13306519和ADIPOQ rs1501299與血脂存在一定相關性，提示這些基因可能通過調節機體脂質代謝等途徑參與T2DM的發生發展。鑒于本研究為橫斷面且樣本容量相對較小，有待更深入地對脂肪因子相關基因與T2DM的發生風險和致病機制進行研究。