芍藥醇對叔丁基過氧化氫損傷的血管內皮細胞的保護作用

潘達，胡飛虹，金燦，聞浩，孟偉陽，朱烈烈，陳大慶

（溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院，浙江 溫州 325027；1.急診醫學科；2.脊柱外科）

內皮細胞（endothelial cell，EC）在調節血管功能、生理和病理生理過程中起著至關重要的作用。氧化應激誘導血管內皮細胞損傷是誘發腦卒中、動脈粥樣硬化、高血壓和糖尿病等心血管疾病的一個重要因素[1-2]。因此，尋找能夠對抗活性氧引起的氧化應激和細胞凋亡、可治療動脈粥樣硬化的自由基清除劑具有重要臨床意義。芍藥醇（paeonol，PAE）是一種從中藥中分離出來的活性化合物，如牡丹皮、芍藥和日本薯。PAE既可用作食品添加劑又可用作傳統的東方藥物[3-5]，用于治療各種疾病，包括炎性疾病和動脈粥樣硬化[6]。PAE生物學和藥理學活性廣泛，研究顯示其具有抗動脈粥樣硬化、抗炎、抗氧化活性，抗糖尿病作用和抗腫瘤作用[3，6-7]。然而，目前還尚不清楚PAE是否可以預防叔丁基過氧化氫（tert-butyl hydroperoxide，TBHP）誘導的內皮細胞凋亡以及與其發生相互作用的細胞內因子。本研究擬探討PAE對TBHP損傷的血管內皮細胞的保護作用及其機制，為PAE防治心血管疾病提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 材料 人臍靜脈內皮細胞系（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）購于美國ATCC，并以含10%胎牛血清的1640培養基培養。PAE購于美國Sigma公司，二甲基亞砜（DMSO）購于美國Sigma公司，4 ℃儲存。乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。CCK8購于日本同仁公司。Transwell小室購于美國康寧公司。兔抗人Cleaved-caspase 3多克隆抗體以及AlexaFluor 555驢抗兔二抗均購于美國Abcam公司。熒光倒置生物顯微鏡購于美國萊卡公司；Bio-Rad 550酶標儀購于美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 分組：體外培養HUVECs分為對照組（Control組）、造模組（TBHP組）和PAE處理組（各濃度PAE+TBHP組）。

1.2.2 細胞培養、處理：HUVECs使用含10% FBS的1640完全培養基培養，待細胞長至80%～90% 時，用PBS清洗2次，加入0.025%胰酶（含0.02% EDTA）消化。等細胞全部脫壁漂浮后，加入3倍體積的完全培養基中和胰酶，1 000 r/min離心5 min，棄去上清，用完培重懸HUVECs，調整細胞濃度為1×104個/mL的細胞懸液待用。PAE溶于DMSO中，配成100 mg/mL母液保存于4 ℃冰箱。所有濃度的PAE均由母液稀釋于1640培養基中。

1.2.3 CCK8實驗檢測PAE毒性及抗氧化作用：取各組上述細胞懸液按100 μL/孔接種于96孔板中培養。將培養板在37 ℃ 5% CO2條件下的恒溫培養箱中預培養24 h后，分別用不同濃度的PAE（12.5、25、50、100 μmol/L）處理不同組別的細胞，再放入培養箱培養48 h。用于毒性測試的細胞，向每孔加10 μL CCK8溶液；用于抗氧化檢測的細胞用TBHP刺激4 h后，向每孔加10 μL CCK8溶液，移入培養箱中繼續避光孵育1 h，取出培養板，用全自動酶標儀測定每孔的吸光度（OD）值，測定波長450 nm，并繪制細胞增殖曲線。每個樣品每次含有3個復孔，結果來自3次獨立重復的實驗。

1.2.4 LDH釋放實驗檢測HUVECs活性：HUVECs在96孔板中以每孔1×104的密度培養，并使其生長至所需的密度。將細胞用PAE（12.5、25、50、100 μmol/L）預處理48 h，然后再用TBHP刺激4 h。將Control組的數值作為細胞活力的標準參數。使用LDH分析試劑盒分析釋放到培養基中的LDH以確定LDH活性。每個樣品每次含有3個復孔，結果來自3次獨立重復的實驗。

1.2.5 Transwell遷移實驗：HUVECs在96孔板中以每孔1×104的密度培養，并使其生長至所需的密度。將細胞用PAE（12.5、25、50、100 μmol/L）預處理48 h，然后再用TBHP刺激4 h。隨后用100 μL無血清的1640培養基重懸各組HUVECs置于孔徑為8 μm的transwell小室上部。最后將1640 培養基（600 μL）和2%胎牛血清加入小室的下部。將細胞在37 ℃下培養48 h。棄去培養基，用濕棉簽擦拭每個transwell小室膜的上部以除去未遷移的細胞。遷移的細胞用4%多聚甲醛固定，并用0.2%結晶紫染色（北京索萊寶公司）。從6個隨機選擇的顯微鏡視野計數平均遷移細胞數。

1.2.6 流式細胞實驗檢測細胞凋亡：將HUVECs（約1×105個細胞/孔）鋪板于6孔板中。然后用不同劑量的PAE處理48 h，然后再用TBHP刺激4 h。接著用冷的磷酸鹽緩沖鹽水洗滌，并以2 000 r/min離心10 min以重懸于binding buffer中。然后加入5 μL膜聯蛋白V-FITC，在黑暗中孵育15 min。在流式分析之前將5 μL碘化丙啶加入管中。使用BD FACSCalibur流式細胞儀（購于美國BD公司）進行流式細胞術分析，并通過Flowjo軟件進行分析。每個樣品每次含有3個復孔，結果來自3次獨立重復的實驗。

1.2.7 免疫熒光檢測細胞凋亡：將Hela細胞接種到96孔板上。待細胞黏附到板上后，向細胞中加入不同濃度的PAE（12.5、25、50、100 μmol/L）預處理48 h，然后再用TBHP刺激4 h。將細胞用4%多聚甲醛固定，0.1% Triton通透，5%山羊血清封閉，最后將Cleaved-caspase 3一抗（1:200，美國Cell Signaling Technology公司，#9664），加入到各個孔中，4 ℃冰箱過夜。第2天取出96孔板，吸出一抗，并用PBS清洗3遍，加入AlexaFluor 555二抗（1:300稀釋），37 ℃孵育1 h，加入DAPI染核5 min，應用抗熒光淬滅劑封固。在熒光顯微鏡下觀察染色的細胞。

1.3 統計學處理方法 采用Graphpad Prism 5.0軟件進行統計學分析，所有實驗均重復3次。計量資料用表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度PAE對TBHP誘導的HUVECs增殖的影響

PAE的化學分子式見圖1A。與Control組比，PAE+THBP組HUVECs的增殖能力較高，差異有統計學意義（P＜0.05）；HUVECs的增殖能力隨著PAE濃度的增加而增加，50和100 μmol/L PAE處理組的HUVECs增殖能力差異無統計學意義（P＞0.05），且以50 μmol/L為最適濃度，見圖1B。

圖1 各個濃度的PAE對TBHP誘導的HUVECs增殖的影響

2.2 不同劑量PAE對TBHP誘導的HUVECs抗氧化應激的影響 與Control組比，TBHP組細胞活力顯著降低，而LDH釋放升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。與TBHP組比，PAE+TBHP組細胞活力顯著增加，LDH釋放顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；50和100 μmol/L PAE組的HUVECs細胞活力和LDH釋放差異無統計學意義（P＞0.05），PAE發揮抗氧化應激活性以50 μmol/L為最適宜濃度，所以下面實驗取25和50 μmol/L PAE，見圖2A和2B。

2.3 不同劑量PAE對TBHP誘導的HUVECs遷移能力的影響 與Control組比，TBHP組HUVECs遷移能力顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；與TBHP組比，各濃度PAE+TBHP組HUVECs的遷移能力顯著提高，差異有統計學意義（P ＜0.05）；遷移細胞個數隨著PAE濃度的增加而增大，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3A和3B。

圖2 PAE對TBHP誘導的HUVECs細胞活力和LDH釋放的影響

2.4 不同劑量PAE對TBHP誘導的HUVECs凋亡的影響 不同劑量PAE預處理48 h后，TBHP誘導的凋亡細胞的數量以劑量依賴性方式減少，差異有統計學意義（均P＜0.05），見圖4A和4B。與Control組比，TBHP組Cleaved-caspase 3的熒光強度顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與TBHP組比，各劑量PAE+TBHP組Cleaved-caspase 3的表達下降，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖5A和5B。

圖3 PAE處理對TBHP誘導的HUVECs遷移的影響

圖4 流式細胞學檢測PAE對TBHP誘導的HUVECs凋亡的影響

3 討論

血管內皮是由一薄層上皮單核細胞組成，位于血管壁組織和血液之間，其復雜的系統具有多功能和分布廣泛的特點；血管內皮在調節血液循環、抵抗炎癥侵襲以及維持血管內外穩態方面起到至關重要的作用。內皮細胞氧化應激損傷是高血壓、糖尿病、動脈粥樣硬化的早期病理改變，隨著氧化應激的進行，細胞內氧自由基的堆積會促使細胞的凋亡[8]。因此，預防和拮抗內皮細胞氧化應激損傷及其誘導的凋亡成為國內外學者研究的熱點和難點[9]。

細胞凋亡主要通過2種主要途徑，一種涉及死亡受體，另一種涉及細胞應激途徑。這兩條途徑在caspase-3活化時會聚，因此caspase-3被認為是細胞凋亡發病機制中的關鍵酶。當全長caspase-3（32 kDa）被激活時，它被切割形成兩個成熟亞基：p17（17 kDa）和p12（12 kDa）；因此Cleaved-caspase 3的水平代表活化的caspase-3的水平[10-11]。細胞凋亡會造成細胞膜結構的破壞，會導致細胞漿內的LDH釋放到細胞外，所以檢測細胞外LDH的含量就可以反映細胞的存活狀態[12]。

圖5 免疫熒光檢測PAE對TBHP誘導的HUVECs凋亡的影響

PAE是一種從中藥中分離出來的活性化合物，其具有廣泛的生物學和藥理學活性，例如：抗動脈粥樣硬化、抗炎、抗氧化活性，抗糖尿病作用和抗腫瘤作用[3，6-7]。本研究選取正常細胞HUVECs為實驗材料，通過TBHP誘導建立氧化應激損傷細胞模型，通過CCK8及LDH釋放檢測旨在初步探討PAE是否具有拮抗由TBHP誘導的血管內皮細胞氧化應激損傷的功能。本研究結果表明，PAE具有促進HUVECs的增殖能力且與藥物劑量正相關，并能顯著增加細胞活力，PAE可以發揮抗氧化應激損傷作用，保護內皮細胞膜的完整性，從而減少從胞質釋放入培養基的LDH。為了探索存活下的內皮細胞功能是否完整，進一步進行transwell實驗，結果顯示在用PAE處理后，顯著改善了由TBHP氧化應激造成的內皮細胞功能的缺失，恢復了HUVECs的遷移能力。隨著細胞氧化應激，細胞會募集并激活caspase-3，進而誘發Caspase家族級聯反應，最終導致細胞凋亡[8]。流式細胞和免疫熒光結果顯示，TBHP可誘導HUVECs的凋亡早期階段，而由PAE預處理的HUVECs通過抑制caspase-3蛋白的活化使其細胞凋亡水平明顯減弱。

本研究采用TBHP誘導的HUVECs氧化損傷模型考察PAE的抗氧化損傷作用。結果表明，PAE通過抑制TBHP誘導的HUVECs存活率降低、LDH釋放增加、細胞遷移減少，細胞凋亡增多、caspase-3蛋白的表達上調，從而發揮其對TBHP損傷的血管內皮細胞的保護作用。因缺乏體內實驗的驗證，本研究的結果具有一定的局限性，但本研究為PAE的進一步開發提供了一定的理論基礎。