CPEB4沉默對宮頸癌Siha細胞的增殖、遷移和侵襲的影響

綦春蕾 于月成

宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率一直居高不下，嚴重威脅著全球女性的身心健康[1-2]。隨著細胞篩查技術和治療技術的不斷進步，宮頸癌的診斷和治療已明顯改善[3]。然而由于早期臨床癥狀不明顯，許多患者發現時已為晚期且往往伴隨著遠端轉移，預后極不理想[3]。因此，進一步探索宮頸癌的發生發展機制，尋找宮頸癌的早期診治靶標，對于宮頸癌的治療和改善預后具有重大意義。胞質聚腺苷酸化元件結合蛋白4(cytoplasmic polyadenylation element binding protein 4，CPEB4)是一種RNA結合蛋白，可調控許多信使RNA的表達[4-5]。CPEB4已被證實在多種腫瘤中存在異常表達，且與癌癥細胞的凋亡、侵襲和遷移等密切相關[5]，但其在宮頸癌中的表達及其具體功能還知之甚少。本文旨在研究CPEB4在宮頸癌組織樣本中的表達，并通過下調CPEB4的表達，研究其對宮頸癌Siha細胞增殖、遷移和侵襲的影響，以期為宮頸癌的診治尋找新靶點。

材料和方法

一、材料與試劑

經患者知情同意后，收集本院2017年5月—2018年5月就診并行手術治療的42例宮頸癌患者，患者年齡25～58歲，平均(38.3±4.2)歲，采集手術切除的癌變組織及其正常癌旁組織，診斷依據病理結果。人宮頸癌Siha細胞購自中國科學院上海細胞庫。DMEM細胞培養液、胎牛血清和胰蛋白酶購自美國Gibco公司；實時定量PCR檢測試劑盒購自日本TaKaRa公司；PCR引物、CPEB4 siRNA和scrambled siRNA均由上海生工生物工程公司合成； TRIzol試劑、脂質體LipofectamineTM3000購自美國Invitrogen 公司；RIPA裂解液、CCK-8細胞增殖檢測試劑盒購自上海碧云天公司；Transwell小室、Matrigel膠購自美國BD公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；CPEB4、P53、Twist1、GAPDH抗體及二抗均購自美國Abcam公司。

二、方法

1.實時定量PCR：TRIzol法分別提取宮頸癌及其癌旁組織總RNA，按照實時定量PCR檢測試劑盒說明書操作，以GAPDH為內參，檢測各組織中CPEB4 的mRNA相對表達量。CPEB4的引物序列為上游5′-CGCCTTCCTCCTCTACAATA-3′、下游5′-ACAGAGCACCGTTATTATTAGCC-3′。GAPDH的引物序列為上游5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′、下游5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。PCR反應條件為95 ℃預變性3 min, 95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環，最后 72 ℃延伸 8 min。

2.細胞培養及siRNA轉染：將宮頸癌Siha細胞培養于含有10% 胎牛血清的DMEM培養基，在37 ℃、5% CO2條件下培養，待細胞匯合度達到80% 左右，胰酶消化傳代，取對數期的細胞用于實驗。轉染前24 h，將細胞按照3×105個/孔接種于6孔板，無血清培養基培養過夜，待細胞匯合度達到50%左右時，按照脂質體LipofectamineTM3000說明書操作，將CPEB4 siRNA或其陰性對照scramble siRNA 轉染至Siha細胞，在37 °C、5% CO2條件下孵育5 h，更換為血清的培養基繼續培養以供后續試驗。

3.CCK-8細胞增殖實驗：細胞轉染后24 h、48 h、72 h、96 h 后終止培養，按照CCK-8細胞增殖檢測試劑盒說明書操作，檢測細胞增殖活性。向每孔細胞中加入20 μl CCK-8溶液，37 °C孵育2 h，酶標儀檢測450 nm處吸光度值。

4.Transwell細胞遷移和侵襲實驗：細胞轉染48 h后，胰酶消化細胞，消化制備細胞懸液，以無血清培養液重懸細胞，濃度為1×106cells/ml。檢測細胞遷移時，取100 μl細胞懸液加入Transwell上室，600 μl含10%血清的DMEM培養液加入Transwell下室，在37 °C、5% CO2條件下培養，24 h后采用4%多聚甲醛固定10 min，0.1% 結晶紫染色15 min，倒置小室，顯微鏡下計數。檢測細胞侵襲時，先向Transwell小室上均勻鋪上以無血清培養基稀釋的Matrigel基質膠，待成膠后再加入細胞懸液，其余操作同細胞遷移實驗。

5.Western blot實驗：采用RIPA裂解提取分癌組織、癌旁組織和癌細胞中的總蛋白，經10% SDS-PAGE分離后電轉移至PVDF膜，用5% 脫脂奶粉溶液常溫封閉1 h后，分別加入抗CPEB4、P53、Twist1、GAPDH的抗體，4 ℃孵育過夜，再加入二抗，常溫孵育1 h，加入發光液，顯色成像，采用ImageJ分析條帶。

6.統計學處理：所有實驗均重復3次，結果數據以均數±標準差表示。應用SPSS 22.0軟件對數據進行統計學處理，采用組間單因素方差分析或LSD-t檢驗進行比較，P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、CPEB4在宮頸癌組織中的表達

比較宮頸癌組織和癌旁正常組織中CPEB4的表達，結果顯示，CPEB4 mRNA在宮頸癌組織中的表達顯著高于癌旁組織(圖1，P<0.05)，且CPEB4蛋白的表達較癌旁組織也顯著上調(圖1，P<0.05)，提示CPEB4的異常上調可能在宮頸癌的發生發展中起重要作用。

二、CPEB4表達下調對宮頸癌Siha細胞增殖的影響

干擾CPEB4基因在宮頸癌Siha細胞中的表達(圖2，P<0.05)，觀察細胞增殖能力的改變。結果顯示，與對照組相比，轉染CPEB4 siRNA后，Siha細胞增殖能力顯著降低(圖2，P<0.05)。

三、CPEB4表達下調對宮頸癌Siha細胞遷移和侵襲的影響

與對照組相比，轉染CPEB4 siRNA后，Siha細胞的遷移和侵襲能力均顯著下降(圖3，P<0.05)。

四、CPEB4表達下調對P53和Twist1蛋白表達的影響

為探究CPEB4影響宮頸癌Siha細胞增殖、遷移和侵襲的可能機制，檢測CPEB4基因沉默前后，Siha細胞中增殖相關蛋白P53和遷移侵襲相關蛋白Twist1的表達。結果顯示，與對照組相比，轉染CPEB4 siRNA后，Siha細胞中P53蛋白表達顯著上調，Twist1蛋白表達顯著下調(圖4，P<0.05)。

Note:Compared with pericarcinomatous tissues, *P<0.05圖1 CPEB4在宮頸癌組織中的表達Figure 1 The expression of CPEB4 in NSCLC and pericarcinomatous tissues

Note:Compared with the control group, *P<0.05圖2 CPEB4對宮頸癌Siha細胞增殖的影響Figure 2 Effect of CPEB4 on proliferation of cervical cancer Siha cells

Note:Compared with the control group, *P<0.05圖3 CPEB4對宮頸癌Siha細胞遷移和侵襲的影響Figure 3 Effect of CPEB4 on migration and invasion of cervical cancer Siha cells

Note:Compared with the control group, * P<0.05圖4 CPEB4對宮頸癌Siha細胞P53和Twist1蛋白表達的影響Figure 4 Effect of CPEB4 on P53 and Twist1 expression in cervical cancer Siha cells

CPEB4可以調控多種信使RNA的表達，進而影響腫瘤細胞的增殖、凋亡、血管生成以及侵襲遷移等[4-5]。研究發現，CPEB4在乳腺癌、膠質瘤、胃癌等多種癌癥中高表達[6-8]，其表達異常影響著這些癌癥的發生和發展，但其在宮頸癌中的表達及其具體功能仍不清楚。本研究發現，CPEB4在宮頸癌患者癌組織中的表達水平顯著高于相應癌旁組織；沉默CPEB4在宮頸癌Siha細胞中的表達可導致細胞增殖活性減弱、遷移和侵襲能力降低，其機制可能與P53蛋白表達上調、Twist1蛋白表達下調有關。

研究表明，與正常組織或癌旁組織相比，CPEB4在胰腺癌組織、乳腺癌組織和膠質瘤組織中均表達上調[4,6-7]。與這些研究類似，本研究發現宮頸癌組織中CPEB4 的mRNA 和蛋白表達水平均顯著高于癌旁組織，提示CPEB4可能參與了宮頸癌的發生和發展。

癌癥是以細胞異常增殖和轉移為主要特點的疾病，因此抑制癌細胞的異常增殖和轉移侵襲有助于限制癌癥的發生和發展。研究發現，采用siRNA干擾CPEB4的表達能夠顯著抑制膽囊癌細胞的增殖和克隆形成能力[9]。沉默胃癌細胞中的CPEB4表達亦可抑制胃癌SGC7901細胞的增殖[8]。與這些發現類似，本研究結果顯示，沉默CPEB4在宮頸癌Siha細胞中的表達，細胞的增殖活性顯著降低，提示通過調控CPEB4的表達能夠影響宮頸癌細胞的增殖。

癌癥細胞發生侵襲轉移往往會導致治療失敗，也成為癌癥患者死亡的主要原因。在乳腺癌MCF7細胞和膠質瘤T98G細胞中過表達CPEB4均可促進細胞的遷移和侵襲，而在乳腺癌MDA-MB-231細胞和膠質瘤SKMG-4細胞中敲除CPEB4均能抑制細胞的遷移和侵襲[6-7]。抑制CPEB4表達也可減少膽囊癌GBC-SD細胞、胃癌SGC7901的遷移和侵襲[8-9]。本研究發現，沉默CPEB4在宮頸癌Siha細胞中的表達，細胞的遷移和侵襲能力均顯著下降，提示CPEB4的表達能夠影響宮頸癌細胞的遷移和侵襲。

作為一種腫瘤抑制基因，P53被發現在宮頸癌中低表達，且與宮頸癌細胞的增殖、侵襲等密切相關[10-11]。Twist1是細胞上皮間質轉化的重要調控因子，在宮頸癌中存在高表達，與宮頸癌細胞的發生、浸潤和轉移密切相關[12-13]。本研究發現，沉默CPEB4在宮頸癌Siha細胞中的表達，細胞中P53蛋白表達上調、Twist1蛋白表達下調，提示CPEB4可能通過調控P53和Twist1的表達影響宮頸癌細胞的增殖、侵襲和轉移。然而影響癌癥細胞生物學行為的因素有很多，CPEB4發揮功能所涉及的具體信號調控網絡仍有待于進一步的研究探討。

綜上所述，在宮頸癌中存在CPEB4的異常高表達，其可能通過調控P53、Twist1 蛋白表達影響宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲。CPEB4有望成為宮頸癌診斷標志物及潛在的治療靶點，然而其發揮功能所涉及的具體信號調控網絡尚需進一步研究。