武漢市男性精子DNA碎片率與年齡及精液常規參數的相關性研究

呂晶 馬玲 張銘 史蕾 覃菊玲 洪志丹

男性不育癥是夫妻不孕不育的重要因素之一。國內有研究顯示，約有15%的育齡期夫婦患有不育癥或曾面臨不育問題，其中男方因素約占50%[1]。目前，精液常規分析作為臨床上最常用的評估男性生育能力的指標，在需篩選優質精子的輔助生殖技術等領域存在一定的局限性，已不能滿足臨床要求[2-3]。作為傳統常規精液檢查的重要補充，精子DNA碎片率(DNA fragmentation index，DFI)檢測為判斷精子質量的優劣提供了一個新的參考方法[4]。隨著對精子DNA損傷研究的深入，研究者們發現精子DFI能更好地評估男性生育力，同時在預測輔助生殖技術助孕結局上具有尤為重要的作用[5]。因此，檢測精子DFI對不育患者精子質量的評估具有極大的價值。本文旨在分析精子 DNA碎片率與患者年齡、精液常規參數的相關性，研究精子DNA損傷在評估男性生育能力中的應用價值。

資料與方法

1.一般資料：選擇2015年6月—2018年12月在武漢大學中南醫院生殖醫學中心就診的2 963名男性作為研究對象。納入標準包括(1)武漢市常駐人口；(2)年齡18歲及以上；(3)精子濃度≥5×106/ml；(4)取精過程無遺漏；(5)男性生殖系統體格檢查(包括第二性征、陰莖、陰囊、精索、輸精管、附睪、睪丸等)均無異常者等。

2.標本收集：患者禁欲2～7 d，手淫法收集新鮮精液于潔凈廣口取精杯內，立即放置于35℃溫箱中液化后將標本分成兩份，一份行常規精液分析，一份行精子DFI檢測。

3.精子DNA碎片率檢測：采用精子染色質擴散法(sperm chromatin dispersion,SCD)檢測精子DFI，使用安徽安科生物科技有限公司的精子DNA碎片染色試劑盒(產品備案號：皖合械備20160005)。嚴格按照說明書進行操作，在普通光學顯微鏡下觀察計數200條以上精子，計數存在DNA碎片的精子的數量。判斷標準為精子頭部僅產生較小的光暈或無光暈，或單側光暈的厚度不超過精子頭部最小直徑的1/3，均被判斷為存在DNA碎片的精子。精子DFI=存在DNA碎片的精子個數/計數總精子個數×100%。

4.精液分析：根據《世界衛生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》第五版標準[6]，通過應用計算機輔助精液分析系統(CASA)分析精子常規參數。將10 μl已經完全液化的精液加至以色列產精子計數板(Makler counting chamber，sefi-medical instruments)配合CASA進行分析，得到精子濃度、總活力、前向運動精子百分率等并記錄。

5.統計學處理：應用SPSS16.0統計軟件進行分析。計量資料采用均數±標準差表示；變量間的相關性分析采用Pearson相關分析，以P<0.01為差異有統計學意義。多因素間的相關性分析采用多元線性回歸分析，以R2>0.25為大效應，顯著性值P<0.001表明有極顯著的統計學意義。

結果

1.精子DFI與患者年齡、精液常規參數一般情況：2 963例患者的年齡、精液常規參數及精子DFI均符合正態分布。患者年齡平均為(33.9±6.3)歲，禁欲時間為(3.9±1.3)d，精液液化時間為(28.0±8.3)min，精液量為(3.4±1.5)ml，精子濃度為(62.2±43.7)×106/ml，精子總數為(198.9±156.4)×106精子/每次射精，精子總活力為(47.2±17.5)%，精子正常形態率為(6.1±2.4)%，精子DFI為(12.5±7.5)%。

2.精子DFI與患者年齡、精液常規參數的相關分析結果：Pearson相關分析結果顯示，精子DFI與患者年齡(r=0.254,P<0.01)、禁欲時間(r=0.181,P<0.01)、液化時間(r=0.094,P<0.01)、精液量(r=0.062,P<0.01)、精子總數(r=0.056,P<0.01)均呈正相關，精子DFI與精子總活力呈負相關(r=-0.505，P<0.01)，精子DFI與精子正常形態率呈負相關(r=-0.212，P<0.01)；精子濃度與精子DFI不存在相關性(P>0.01)。

3.多元線性回歸分析結果：構建模型后得到R2=0.325、調整R2=0.324、Durbin-Watson=1.856，R2>0.25表明為大效應，模型擬合優度較高，同時DW值接近2，認定殘差獨立通過檢驗。進一步采用F檢驗方法對回歸方程進行顯著性檢驗,得到結果F=356.272，P<0.001，表明回歸方程有極顯著的統計學意義。表1數據顯示，患者年齡、精子總數、活力、正常形態率與精子DFI之間的線性伴隨變化有極顯著的統計學意義(t年齡=10.377，P<0.001，t精子總數=12.839，P<0.001，t精子總活力=-30.480，P<0.001，t精子正常形態率=-4.087，P<0.001)。回歸方程為精子DFI=15.827+0.189×年齡+0.01×精子總數-0.22×精子總活力-0.208×精子正常形態率，說明當患者年齡增長1歲，精子DFI值會增長0.189%；當精子總數增長1×106，精子DFI值會增長0.010%；當精子總活力增長1%，精子DFI值會降低0.220%；當精子正常形態率增長1%，精子DFI值會降低0.208%。回歸分析顯示標準化殘差左右兩側對稱，P-P圖中散點均靠近斜線，回歸殘差滿足正態性。

討論

人類精子DNA損傷是一種常見的男性生殖能力下降的原因[7]。在各種內外環境及遺傳因素的影響下，如年齡、生活作息、吸煙、環境污染、某些疾病感染等，均會導致精子DNA不同程度的損傷[8]。目前認為，導致精子DNA損傷主要有3個原因，即精子染色質組裝異常，精子細胞的異常凋亡及氧化應激反應[9-10]。而染色質組裝異常是其損傷的主要原因[7]。為確保DNA雙鏈結構的穩定，精子在成熟過程中大量巰基被氧化成二硫鍵，使得DNA結合更緊密，但當其被多種有害的因素影響時，發育異常的精子中巰基未被氧化成二硫鍵，DNA由雙鏈斷裂，或變形為單鏈，這樣就形成精子DNA碎片[11]。常用于檢測精子 DNA 完整性的方法有精子染色質結構分析(sperm chromatin structure assay，SCSA)、彗星實驗(comet assay)、末端轉移酶介導的dUTP末端標記法(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)和SCD法[12]等。相較而言，SCD法具有操作簡便、快捷、準確、經濟、重復性較好等優點[13]，自2003年Fernandez等[14]發明以來已被廣泛應用于精子 DNA 完整性的研究。本研究采用SCD法檢測精子DNA完整性，結果可靠。

表1 精液常規參數在方程中的回歸系數結果

學者們對男性不育患者的年齡與其精子DFI相關性的研究比較多。本研究顯示，隨著男性年齡的增加，精液中精子DFI顯著升高，與大多數學者的研究結果一致[15-17]。究其原因，現有的研究數據表明，隨著男性年齡增長，睪丸、前列腺和附睪等器官逐漸老化，導致活性氧自由基( reactive oxygen species，ROS) 增多及其抗氧化能力下降[18]。ROS生成量超過了精子抗氧化的防御能力的極限，那么就會導致機體內活性氧積聚，誘導氧化應激損傷精子質膜完整性和流動性，最終損傷精子核 DNA[19]。男性隨著年齡增加而引起的精子DNA損傷，將會影響胚胎發育，除導致不良的輔助生殖結局外，還增加胎兒出生缺陷發生及子代異常的風險[20-21]。可見，加強精子DNA完整性的檢測，對于評價男性不育具有重要的作用。

精子活力和精子正常形態率作為精液常規分析中的兩個重要參數，也反映著男性的生育力。本研究中，精子DFI與精子活力、精子正常形態率呈負相關，與新疆[22]、深圳[23]、上海[24]、沈陽[25]等多地區對男性不育患者的年齡、精液參數與其精子DFI相關性的研究結論一致。精子線粒體作為調節精子運動的主要細胞器，提供精子運動所需主要能量來源，在精子DNA損傷后該細胞器產生的能量異常會導致精子活動能力的下降[26]，而引起男子不育。還有學者認為，過多的精子DNA鏈斷裂，可誘導精子細胞凋亡，反映在精子形態結構、精子活動率以及前向運動精子等活動狀態[27]。本研究結果中，精子DFI與精液量、精子總數呈正相關，但精子濃度與精子DFI關系分析無統計學意義。在很多學者的研究結果中，精液量和精子濃度與DFI的關系是有爭議的，但對精子總數與DFI的關系研究不多。自然受孕或輔助生殖助孕過程中，除精子活力外，一次射精的總數仍起重要作用。臨床檢驗過程中，因檢測方式的局限性，對于精子濃度極低的標本，無法進行精子DFI的檢測。因此，不排除是因樣本選擇的局限性導致精子濃度與DFI的陰性結果。另外，本研究結果顯示，禁欲時間、液化時間等與精子DFI均呈正相關，與此前研究結果一致[28]。考慮因精液中精子細胞是ROS的主要內源性來源[29]，隨著禁欲時間延長，精液量相對增多，累積的精子總數亦增多，引起內源性ROS增高，從而導致DFI增高。

本研究分析了精子DFI與年齡、精液常規等兩兩之間的關系，為了更直觀的了解到各參數對DFI影響更直觀的結果，將相關性較高且學者們關注的較多的男性年齡、精子總數、活力、正常形態率等因素進一步進行多因素分析，得到了具有極顯著統計學意義的結果，并可以根據回歸方程在一定程度上預測其對應精子DFI情況。

綜上所述，精子DNA完整性與年齡及精子總數、活力、正常形態率等均相關，年齡是導致DFI升高的關鍵因素，DFI升高亦可導致精子活力與正常形態率等下降。精子DFI結合精液常規檢查能更好地評估男性生育力，為進一步的研究精子DFI與男性不育等更深入的機制研究提供了理論基礎。本次研究尚存在不足，如未納入精子濃度<5×106/ml的標本，未依據年齡和精子DFI進行更細化的分組。今后有必要擴大檢測地域，加大樣本量，并進行更細化的分組等深入研究。