長鏈非編碼RNA lncAdam-9表達與早產胎膜早破關系的研究

冀云鵬 張俊繪 王曉華 楊曉彥 劉愛菊 王婷婷 趙慧敏 王桂香

早產是指妊娠滿28周但不足37周的分娩。胎膜早破(premature rupture of membrane，PROM)是指臨產前發生胎膜破裂，通常發生在孕37周后。如果PROM發生在孕28周至37周之間，則被定義為早產胎膜早破(preterm premature rupture of membrane，PPROM)。PPROM發生率約2%～4%[1]。人類基因中將近98%的DNA序列被發現能夠轉錄成非編碼RNA (noncoding RNA，ncRNA)[2]。近期的基因組研究表明，人類基因組能夠轉錄和產生多種調節型ncRNA，其中長鏈非編碼RNA (long noncoding RNA，lncRNA)在不同組別的胎盤組織中存在差異表達，并涉及多種生物學通路[3-4]。I型血小板結合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin-like motifs, Adamts)家族成員可以調控膠原蛋白基質的降解過程，本研究將探討該家族重要成員Adamts-9 lncRNA在PPROM中的調控作用，為今后探索胎膜早破及早產發病機制、預防早產提供臨床科研信息。

對象與方法

一、對象

選取2017年3月至2018年3月在內蒙古自治區婦幼保健院產科分娩的孕婦，共120例。根據孕婦的分娩孕周以及胎膜早破情況，將孕婦分為：(1)早產胎膜早破組。年齡24～42歲，平均年齡(30.1±4.1)歲；孕周28～36周，平均孕周(34.0±2.4)周。(2)早產非胎膜早破組。年齡25～40歲，平均年齡(29.9±3.7)歲；孕周29～36周，平均孕周(34.0±2.5)周。(3)足月胎膜早破組。年齡24～35歲，平均年齡(29.4±3.1)歲；孕周37～41周，平均孕周(39.2±1.1)周。(4)足月非胎膜早破組。年齡24～41歲，平均年齡(30.4±3.9)歲；孕周38～41周，平均孕周(40.1±0.9)周。每組30例。早產以及胎膜早破的診斷參照第八版婦產科學的診斷標準[5]，即早產為妊娠滿28周但不足37周之間分娩；胎膜早破即在臨產前出現胎膜自然破裂。所有標本均在胎盤胎膜娩出后5 min內進行采集，沿胎膜破口邊緣一周，剪下距離破口邊緣寬度為2 cm的胎膜組織，然后分剪成6塊2 cm×2 cm的胎膜組織，分別裝入標本袋中，將分組，姓名，年齡，住院號等基本信息進行標記。標本采集后15 min內放入-80 ℃冰箱凍存待用。研究前，由醫師與孕婦或其家屬簽署知情同意書，記錄孕婦的基本臨床信息。所選孕婦均為自然受孕且經陰道自然分娩，除外剖宮產手術分娩者。

二、方法

1.樣本RNA提取(Trizol法)：取50～100 mg胎膜組織，加入1 000 μl Trizol，冰上勻漿，震蕩混勻，室溫放置5 min。加入200 μl氯仿震蕩混勻10 s，室溫放置3 min，待溶液分層后，4 ℃、12 000 rpm 離心15 min。吸水相(上清)到尖底離心管(RNase-Free)中，各加入400 μl 異丙醇(RNA沉淀)，緩慢顛倒混勻，-20 ℃放置30～60 min。取出4℃、12 000 rpm離心15 min。RNA沉于離心管底部，棄上清，加入1 ml 75%乙醇(RNase-Free超純水配制)，輕輕吹打洗滌沉淀，4℃、12 000 rpm 離心10 min。棄上清，室溫干燥5～10 min(去除乙醇)，加入15～20 μl RNase-Free H2O溶解RNA。

2. RNA質檢：(1)微量分光光度計檢測濃度及純度。滴加2 μl待測RNA樣品至檢測臺進行檢測，讀值。(2)瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。①制膠；②電泳，取1.5 μl RNA樣本上樣電泳；③觀察紫外透射光下觀察并拍照。合格情況可見28S和18S核糖體RNA的條帶亮而濃。

3.反轉錄：(1)反轉錄體系。包括Random Primer1μl、Total RNA1μg、5× 酶緩沖液 4 μl、dNTP mix 2 μl Protector RNase Inhibitor 1 μl 和Transcriptase 1 μl，最終用RNase-free ddH2O 補足到20 μl。(2)反轉錄程序。25 ℃，5 min；42 ℃ 60 min；70 ℃，5 min；所得cDNA低溫保存。

4.熒光定量PCR：(1)引物。①設計內參基因B2M上下游特異引物。B2M-F 5′ CTCTTTCTGGCC TGGAGGCTAT 3′, B2M-R 5′ AGTCAACTTCAATG TCGG- ATGGAT 3′, 退火溫度設為60 ℃，產物長度為135 bp；②設計lncAdamts-9上下游特異引物。Lnc-ADAM9-F 5′ TACATACAATGGTCAGATGGCAAA 3′, Lnc-ADAM9-R 5′ GCCTTGATGGGAACTGCTGA 3′, 退火溫度設為60 ℃，產物長度為169 bp；③設計Adamts-9 cDNA上下游引物。ADAM9-F 5′ GCCAC-TGGGAATGCTTTGT 3′，ADAM9-R 5′ GCA GTATTCATTTCATTGT- ATGTAGGT 3′, 退火溫度為60 ℃，產物大小為392 bp。

(2)Real-time PCR。①PCR反應體系與加樣。2 × Master Mix(Roche)5.0 μl、PCR特異引物(10 μM)0.6 μl和1μl cDNA，最終加ddH2O至總體積為10 μl，將混合液加到384-PCR板對應的孔中。小心粘上Real-time PCR 專用封口膜，并短暫離心混合。在設置Real-time PCR程序前將準備好的384-PCR板放在冰上。②擴增程序(ABI Quant Studio 6 Flex)。擴增程序設為95 ℃ 10 min、95℃ 15 s、45cycle 60 ℃ 60 s(收集熒光)。為了建立PCR產物的熔解曲線，擴增反應結束后，程序分別設為(95 ℃ 10 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15s，并從60 ℃緩慢加熱到99 ℃(+0.05℃/s，期間收集熒光)。

5.結果與計算：樣品的目的基因和內參基因分別進行Real-time PCR反應。采用ΔΔCт的相對定量：各樣品目的基因和內參基因的Cт值直接由儀器生成。每個樣品的目的基因濃度除以其內參基因的濃度，即為此樣品此基因的校正后的相對含量。

6.統計學處理：應用SPSS 13.0統計軟件，運行獨立樣本t檢驗，取P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、Adamts-9的相對定量結果及統計分析

Adamts-9表達量在早產胎膜早破組(PD & PRM，RQ=1.093)顯著高于早產無胎膜早破組(PD & non-PRM，RQ=0.722；P=0.025)，早產無胎膜早破組(PD & non-PRM，RQ=0.722)要顯著低于足月胎膜早破組(FTD & PRM， RQ=1.381；P=0.009)。此外，在胎膜早破組(早產胎膜早破組+足月胎膜早破組=PD & PRM and PTD & PRM，RQ=1.237)要高于非胎膜早破組(早產無胎膜早破組+足月無胎膜早破組= PD & non-PRM and PTD & non-PRM，RQ=0.876；P=0.02)。見表1。

二、LncAdamts-9的相對定量結果及統計分析

IncAdamts-9在早產胎膜早破組(PD & PRM，RQ=1.096)中含量顯著高于早產無胎膜早破組(PD & non-PRM，RQ=0.710；P=0.025)，早產胎膜早破組(PD & PRM，RQ=1.096)顯著低于足月胎膜早破(FTD &PRM, RQ=1.602；P=0.011)，早產無胎膜早破組(PD & non-PRM，RQ=0.710)顯著低于足月胎膜早破(FTD &PRM, RQ=1.602；P<0.001)，早產組(早產胎膜早破組+早產無胎膜早破組=PD & PRM and PD & non-PRM，RQ=0.903)含量要顯著低于足月組(足月無胎膜早破組+足月胎膜早破組= FTD & non-PRM and FTD &PRM，RQ=1.263；P=0.005) ，胎膜早破組(早產胎膜早破組+足月胎膜早破組= PD & PRM and FTD & PRM，RQ=1.349)要顯著高于非胎膜早破組(早產無胎膜早破組+足月無胎膜早破組= FTD & non-PRM and PD & non-PRM，RQ=0.817；P<0.001) 。見表2。

表1 Adamts-9在4個組胎膜樣本中的相對定量結果Table 1 Relative quantifications of Adamts-9 in four groups of fetal membrane samples

Abbreviation: PD=Premature Delivery; PRM=Premature Rupture of Membrane; non-PRM=non-Premature Rupture of Membrane; FTD=Full-Term Delivery

表2 lncAdamts-9在4個組胎膜樣本中的相對定量結果Table 2 Relative quantifications of lncAdamts-9 in four groups of fetal membrane samples

Abbreviation: PD=Premature Delivery; PRM=Premature Rupture of Membrane; non-PRM=non-Premature Rupture of Membrane; FTD=Full-Term Delivery

討 論

一、lncAdamts-9 可能不直接參與早產發生

lncRNA一般指長度大于200 bp的ncRNA，通常與編碼蛋白的RNA分子以及蛋白分子共同組成復合物。研究顯示，越來越多lncRNA被發現在多種生物學過程調節中發揮重要作用，這些過程涉及剪接、轉錄、定位以及亞細胞區域的組成[6]。目前，許多疾病的病因學研究均強調lncRNA調節作用的重要性，尤其是在那些有遺傳和環境因素共同作用的復雜性疾病中[7]。現有研究表明，PPROM存在遺傳易感性[8]，但基因組相關的研究至今沒有鑒別出引起PPROM的基因。PPROM屬復雜性疾病，涉及基因與環境的相互作用。環境因素已被證明是導致PPROM的重要病因，雖然環境因素不能改變基因的結構，但能夠引起表觀遺傳學調控的改變，進而影響基因的表達。本研究對Adamts-9 基因lncRNA進行相對定量檢測，在早產和足月產、胎膜早破和非胎膜早破樣本進行差異化分析，并對樣本進行了分組(A：早產胎膜早破組，B：足月無胎膜早破組，C：早產無胎膜早破組，D：足月胎膜早破組)，結果發現，足月組(BD)中lncAdamts-9 要高于早產組(AC組)，組間差異有統計學意義，說明lncAdamts-9可能參與了妊娠結局的調控。但是，lncAdamts-9可能不直接和早產相關聯，在4個組中，其在早產無胎膜早破組中水平是最低的，要低于早產胎膜早破組。

二、Adamts基因家族很可能調節胎膜中膠原蛋白含量變化

ADAMTS基因家族屬于細胞外的多結構蛋白酶，根據序列比對結果和蛋白酶的功能不同分為四亞類，即第一亞類降解底物為聚蛋白聚糖，第二亞類降解底物包括I型、II型和III型原骨膠原的肽段[9-11]，第三亞類是血管性血友病因子(von willebrand factor, vWF)的降解蛋白酶，第四亞類為蛋白結構特征相似的蛋白酶。Adamts-8 和Adamts-9基因屬于第一類。研究發現，病毒感染小鼠的胎膜和胎盤中Adamts編碼基因相關lncRNA(lncAdamts-8、lncAdamts-13和lncAdamts-14)的差異表達提示，lncRNA在小鼠胎盤和胎膜組織中可能參與了這些Adamts基因的轉錄水平和轉錄后水平的調節[4]。這些由病毒感染引起的差異表達的lncAdamts可以調控Adamts基因的表達，ADAMTS蛋白含量的改變最終導致早產或胎膜破裂相關高危因素的發生，這些高危因素主要包括胎膜中膠原蛋白和細胞外基質的改變，血管生成異常以及凝血等。本研究結果證明這種推測，在胎膜早破組中(AD)，Adamts-9基因表達量要大于非胎膜早破組(BC)，說明機體在其他因素誘導胎膜早破時，提高了Adamts-9基因表達來抵抗PROM的發生。

三、總結

本研究通過對不同組別(早產、足月、胎膜早破)孕婦胎膜樣本中分析Adamts-9和lncAdamts-9相對含量，探討lncAdamts-9對PROM是否關聯。本研究結果發現，PROM胎膜組織中Adamts-9及lncAdamts-9相比對照組表達量顯著變化，Adamts-9及lncAdamts-9可能參與PROM的逆向調控。