反復喘息嬰幼兒T-bet/GATA-3比值與潮氣呼吸肺功能及Th1/Th2平衡的關系

唐聞瓊 邢凱慧 吳世麗 蘇麗娜

反復喘息屬于呼吸道疾病之一，嬰幼兒反復喘息發生率較高，同時反復喘息還可增加呼吸道高反應性及哮喘的發生風險[1]。研究顯示，采用肺功能檢測診斷反復喘息嬰幼兒具有重要參考價值，其中潮氣呼吸肺功能檢測指標均對反復喘息嬰幼兒具有較高診斷價值[2]。由于反復喘息嚴重影響患兒生長發育及身心健康發展，因而分析喘息相關影響因素及其可能機制對降低嬰幼兒哮喘發生及提高治療效果均具有重要意義。研究表明，輔助性T淋巴細胞1(T helper cell 1，Th1)與輔助性T淋巴細胞2(T helper cell 2，Th2)比例失衡常可參與哮喘發生及發展過程[3]。研究顯示，γ-干擾素(interferon-γ，IFN-γ)與白細胞介素10(interleukin-10，IL-10)是Th1細胞分泌的主要細胞因子，而白細胞介素4(interleukin-4，IL-4)是Th2細胞分泌的主要細胞因子，IFN-γ/IL-4比值可反應Th1/Th2比值狀態[4]。輔助性T淋巴細胞(T helper cell，Th)定向分化取決于其轉錄因子的表達，相關研究表明T-bet(T-box expressed in T cells)可控制Th細胞分化為Th1，而GATA結合蛋白3(GATA-binding protein-3，GATA-3)可控制Th細胞分化為Th2[5]。關于反復喘息嬰幼兒的T-bet/GATA-3比值與Th1/Th2平衡的相關性研究相對較少，因此，本研究主要探討T-bet/GATA-3比值與反復喘息嬰幼兒潮氣呼吸肺功能及其與Th1/Th2平衡的關系，旨在為臨床診斷及治療提供參考依據。

資料與方法

1.一般資料：選取2017年12月至2018年5月本院收治的反復喘息嬰幼兒86例為反復喘息組，判斷標準均參照相關文獻[6]，其中男52例，女34例，年齡為6～36個月，平均年齡為(23.6±6.2)個月。根據反復喘息嬰幼兒肺功能分度[7]將其分為輕度阻塞組(30例)、中度阻塞組(42例)、重度阻塞組(14例)。同時選取同期在本院兒保門診體檢的健康兒童72例為對照組，其中男37例，女35例，年齡為10～36個月，平均為(22.1±6.4)個月。兩組兒童性別、年齡、營養狀況等臨床資料比較，差異無統計學意義，具有可比性。本研究經本院醫學倫理委員會批準，所有嬰幼兒家長均知情同意。

納入標準包括(1)反復喘息嬰幼兒表現為反復咳嗽且肺部有鳴音；(2)未曾服用免疫抑制劑及免疫調節劑。排除標準包括(1)患有先天性心臟病；(2)支氣管及肺發育不良患兒；(3)支氣管異物等其他原因引起的喘息；(4)先天性氣道發育畸形引起的喘息。

2.樣本采集與分離：分別抽取兩組受試幼兒外周靜脈血5 ml，置于EDTA抗凝試管內，加入磷酸鹽緩沖液稀釋，參照相關文獻提取單個核細胞[8]，并將其置于含有雙抗(1%)與含有胎牛血清的RPMI 1640培養液中待用。

3.實時定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測T-bet、GATA-3 mRNA表達水平：取單核細胞(1×106)并采用TRNzol Universal總RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取細胞總RNA，紫外分光光度計(北京京科瑞達科技有限公司)檢測RNA純度及濃度。根據QuantScript RT Kit試劑盒(北京天根生化科技有限公司)將RNA反轉錄為cDNA。T-bet上游引物序列為5′-TGGTCCAAGTTTAATCAGCACCAG-3′，下游引物序列為5′-CCCGGCCACAGTAAATGACAGG-3′；GATA-3上游引物序列為5′-CCTCATTAA GCCCAAGCGAAG-3′，下游引物序列為5′-TCCAGAGTGTGGTTGTGGTG-3′；β-actin正向引物序列為5′-CAGCCATGTACGTTGCTATCCAGG-3′，反向引物序列為5′-AGGTCCAG ACGCAGGATGGCATG-3′，引物均由北京博爾邁生物技術公司。按照SYBR? Green JumpStart Taq ReadyMix 試劑盒(美國Sigma公司)說明書進行qRT-PCR反應。置于LightCycler96熒光定量PCR儀(瑞士羅氏公司)進行擴增反應，程序設定為95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，共40個循環。采用2-ΔΔCt相對定量法計算T-bet、GATA-3 mRNA的相對表達量。

4.流式細胞儀檢測Th1/Th2細胞百分率：分別取單核細胞(1×106)置于細胞培養液(1ml)內，加入PMA、Ionomycin溶液(終濃度分別為0.1 mg/ml、1mg/ml)及2 μl Golgistop溶液，其中PMA與Ionomycin均購自美國Sigma公司，Golgistop購自美國BD公司。置于培養箱內培養6 h，收集細胞并采用磷酸鹽緩沖液清洗，取3個流式管分別加入CD3-eFluor(5 μl)、CD8a-FITC抗體(5 μl)，室溫孵育30 min，磷酸鹽緩沖液清洗后加入200 μl破膜劑(美國BD公司)，同時分別向2個流式管內加入IFN-γ-PE(5 μl)、抗IL-4-PE(5 μl)，對照管內加入同型對照抗體，室溫孵育30 min，清洗后加150 μl多聚甲醛固定液重懸細胞，置于BD FACS CantoTMⅡ型流式細胞儀(北京東迅天地醫療儀器有限公司)進行檢測，Th1細胞中檢測IFN-γ表達情況，Th2細胞中檢測IL-4表達情況。

5.檢測Th1/Th2細胞因子水平：取兩組兒童靜脈血4 ml，經3 500 r/min轉速離心機離心5 min分離血清，采用酶聯免疫吸附法檢測血清IFN-γ、IL-4、IL-10水平，檢測試劑盒均購自美國Ebioscience公司，Synergy NEO2 HTS全功能酶標儀購自美國伯騰儀器有限公司。

6.潮氣呼吸肺功能檢測：采用Master Screen Paed型兒童肺功能儀(德國耶格公司)檢測兩組受試兒童潮氣呼吸肺功能，需先清理患兒鼻咽與呼吸道分泌物，待兩組受試兒童熟睡后取仰臥位，擇取適合面罩置于口鼻，潮氣呼吸肺功能主要參數包括每千克體重潮氣量(tidal volume per kilogram of body weight，VT/kg)、吸呼比(inhalation time / expiration time，Ti/Te)、達峰時間比(time to peak expiratory flow / time to expiratory，TPTEF/TE)、達峰容積比(volume to peak expiratory flow / volume to expiratory，VPEF/VE)、呼吸頻率(respiratory rate，RR)、潮氣呼吸呼氣峰流速(peak tidal expiratory flow rate，PTEF)。根據TPTEF/TE與VPEF/VE比值范圍將反復喘息嬰幼兒分為肺功能輕度阻塞組、中度阻塞組與重度阻塞組，分析反復喘息嬰幼兒不同肺功能組T-bet/GATA-3比值變化。

結果

1.兩組研究對象T-bet/GATA-3比值比較：反復喘息組患兒T-bet mRNA表達水平與T-bet/GATA-3比值均顯著低于對照組(P<0.05)，而GATA-3 mRNA表達水平顯著高于對照組(P<0.05)，見表1。

2.兩組兒童潮氣呼吸肺功能參數比較：反復喘息組患兒VT、Ti/Te、TPTEF/TE、VPEF/VE均顯著低于對照組(P<0.05)，而RR、PTEF均顯著高于對照組(P<0.05)，見表2。

注：與對照組比較，*P<0.05

3.反復喘息嬰幼兒T-bet/GATA-3比值與潮氣呼吸肺功能的關系：結果顯示，重度阻塞組與中度阻塞組T-bet mRNA表達水平與T-bet/GATA-3比值均顯著低于輕度阻塞組(P<0.05)，且重度阻塞組顯著低于中度阻塞組(P<0.05)；而GATA-3 mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)，且重度阻塞組顯著高于中度阻塞組(P<0.05)，見表3。

采用Pearson法進一步分析反復喘息嬰幼兒T-bet/GATA-3比值與潮氣呼吸肺功能參數的相關性，結果顯示，T-bet/GATA-3比值與VT、Ti/Te呈顯著正相關關系(P<0.05)，而與RR呈負相關(P<0.05)，但與PTEF無明顯相關性(P>0.05)，見表4。

表2 兩組兒童潮氣呼吸肺功能參數比較

注：與對照組比較，*P<0.05

表3 反復喘息嬰幼兒不同肺功能分度與T-bet/GATA-3比值的關系

注：與輕度阻塞組比較，*P<0.05；與中度阻塞組比較，#P<0.05

表4 反復喘息嬰幼兒T-bet/GATA-3比值與潮氣呼吸肺功能參數的相關性分析

4.兩組受試兒童Th1/Th2細胞百分率及其細胞因子比較：反復喘息組患兒Th1與Th1/Th2細胞百分率均顯著低于對照組(P<0.05)，而Th2細胞百分率顯著高于對照組(P<0.05)，見表5。

研究患兒血清IFN-γ水平及IFN-γ/IL-4比值均顯著低于對照組(P<0.05)，而血清IL-4、IL-10水平均顯著高于對照組(P<0.05)，見表6。

5.反復喘息嬰幼兒T-bet/GATA-3比值與Th1/Th2平衡的關系：采用Pearson法分析反復喘息嬰幼兒T-bet/GATA-3比值與Th1/Th2細胞比值的相關性，結果顯示，T-bet/GATA-3比值與Th1/Th2呈正相關(r=0.307，P=0.004)，見圖1。

表5 兩組受試兒童Th1/Th2細胞百分率比較

注：與對照組比較，*P<0.05

表6 兩組兒童Th1/Th2細胞因子比較

注：與對照組比較，*P<0.05

圖1 反復喘息嬰幼兒T-bet/GATA-3比值與Th1/Th2的相關性分析

討論

喘息是嬰幼兒常見呼吸系統疾病之一，而反復喘息可導致哮喘的發生，其主要病理特征為氣流受限與氣道高反應性，嬰幼兒反復喘息與哮喘的診斷及治療是研究難題[9]。肺功能檢測可作為反復喘息及哮喘的輔助診斷，也可作為評估疾病嚴重程度及治療效果的依據[10]。因此，探究嬰幼兒反復喘息的可能發病機理并及時采取干預措施對提高治療效果及改善患兒預后均具有重要意義。

轉錄因子T-bet在哮喘患者肺組織中呈低表達并減少IFN-γ分泌，而轉錄因子GATA-3在哮喘患者肺泡灌洗液及支氣管粘膜活檢組織中呈高表達，其表達水平與患者氣道高反應性呈正相關，而與氣道口徑呈負相關[11-12]。研究表明，哮喘兒童外周血單核細胞中T-bet表達水平低于正常兒童，而GATA-3表達水平高于正常兒童，T-bet/GATA-3比值失衡與兒童哮喘發生及發展密切相關[13]。關于反復喘息嬰幼兒中T-bet/GATA-3比值表達變化的研究相對較少，本研究結果顯示，反復喘息嬰幼兒外周血單核細胞中T-bet表達水平與T-bet/GATA-3比值均低于正常兒童，而GATA-3表達水平明顯升高，說明T-bet與GATA-3均參與嬰幼兒反復喘息過程，T-bet/GATA-3比值降低可能導致嬰幼兒反復喘息的發生。提示嬰幼兒外周血單核細胞中T-bet/GATA-3失衡可作為判斷嬰幼兒反復喘息發生的重要輔助指標。潮氣呼吸肺功能檢測是用于評估嬰幼兒肺功能的技術，研究顯示，TPTEF/TE與VPEF/VE是潮氣呼吸肺功能檢測的重要參數，并可用于評估患兒小氣道阻塞情況，其數值越低提示小氣道阻塞越嚴重[14]。本研究結果顯示，反復喘息患兒VT、Ti/Te、TPTEF/TE、VPEF/VE均低于對照組，而RR、PTEF均明顯升高，VT降低與RR升高可能是由于氣道炎性反應發生增加分泌物生成量并引起下呼吸道阻塞導致肺部通氣及換氣功能障礙，Ti/Te降低說明反復喘息患兒氣道阻塞時呼氣時間過長，TPTEF/TE與VPEF/VE降低說明反復喘息患兒存在阻塞性通氣功能障礙且與阻塞嚴重程度有關，PTEF升高說明反復喘息患兒大氣道阻力增強。進一步分析T-bet/GATA-3比值與反復喘息患兒潮氣呼吸肺功能的關系，本研究根據患兒肺功能將其分為輕度阻塞組、中度阻塞組與重度阻塞組，結果顯示，重度阻塞組與中度阻塞組T-bet表達水平與T-bet/GATA-3比值均低于輕度阻塞組，且重度阻塞組低于中度阻塞組；而GATA-3表達水平升高，且重度阻塞組高于中度阻塞組，說明隨著反復喘息患兒肺功能減弱T-bet/GATA-3比值明顯降低。相關性分析顯示，T-bet/GATA-3比值與VT、Ti/Te呈正相關，而與RR呈負相關，提示T-bet/GATA-3比值與反復喘息患兒潮氣呼吸肺功能密切相關。

T-bet可促進Th細胞分化為Th1細胞，并激活IFN-γ基因表達進而提高其表達水平，同時抑制Th2細胞生成并可將其轉化為Th1細胞[15]。GATA-3可促進Th細胞轉化為Th2細胞并促使Th2細胞因子IL-4生成，同時可抑制Th1細胞生成并促進Th2細胞生成，研究顯示，哮喘患兒T-bet/GATA-3比值可作為衡量Th1/Th2細胞平衡的重要指標[16]。Th1細胞的主要細胞因子IFN-γ可激活巨噬細胞并促使其分泌細胞因子進而發揮抗炎、抗感染免疫等作用，研究表明Th2細胞分泌的IL-4可促使IFN-γ分泌減少并刺激B淋巴細胞產生炎性細胞因子進而促進哮喘等炎癥性疾病發生[17]。關于Th1/Th2失衡與反復喘息嬰幼兒之間關系的研究相對較少，本研究結果顯示，反復喘息患兒Th1、Th1/Th2細胞百分率、血清IFN-γ水平及IFN-γ/IL-4比值均顯著低于對照組，而Th2細胞百分率、血清IL-4、IL-10水平均顯著高于對照組，說明Th1/Th2失衡可促進炎性因子IL-4、IL-10釋放進而加重患兒體內炎癥反應，提示Th1/Th2失衡與嬰幼兒反復喘息發生有關。進一步分析發現T-bet/GATA-3比值與Th1/Th2細胞百分率呈正相關，提示T-bet/GATA-3比值降低促進Th1/Th2失衡進而導致反復喘息嬰幼兒免疫失衡。

綜上所述，反復喘息嬰幼兒外周血單核細胞中T-bet/GATA-3比值降低，并與患兒潮氣呼吸肺功能有關，同時還可導致患兒免疫失衡，有效逆轉T-bet/GATA-3比值可能作為反復喘息嬰幼兒的治療切入點。本研究存在一定不足，關于T-bet與GATA-3在嬰幼兒反復喘息發生及發展過程的具體作用機制有待深入研究。