建立一種基于超高效液相色譜-串聯質譜測定豬肉中地克珠利和妥曲珠利殘留的方法

陳彤 吳雯娟 黃婷 丁燕玲 羅燕

摘 ?要：本文建立了一種檢測豬肉中地克珠利和妥曲珠利殘留的超高效液相色譜-串聯質譜方法。地克珠利和妥曲珠利在10.0 μg/kg～500.0 μg/kg線性范圍內，標準曲線的相關系數（r）均大于0.996，呈現良好的線性關系。地克珠利和妥曲珠利的檢出限分別為1.22 μg/kg和1.25 μg/kg，在加標回收試驗中的回收率范圍分別為81.4%～105.0%和86.0%～103.0%，相對標準偏差范圍為3.8%～6.2%。試驗結果表明，該方法簡單、快速、準確，且檢出限低、回收率高，能適用于豬肉中地克珠利和妥曲珠利殘留的檢測。

關鍵詞：地克珠利;妥曲珠利;殘留;豬肉;超高效液相色譜-串聯質譜

中圖分類號：S859.84 文獻標志碼：A 文章編號：1001-0769（2019）08-0069-04

地克珠利與妥曲珠利都是三嗪類抗球蟲藥物，具有高效、低毒和廣譜的驅球蟲特性，在畜牧業生產中作為抗球蟲藥物被廣泛應用[1]。妥曲珠利被動物吸收后，通過代謝轉化為曲珠利砜和妥曲珠利亞砜。此類藥物的藥效時間短，實際生產中需要長期用藥才能達到防治的目的，因而此類藥物容易殘留累積，經過食物鏈傳遞至消費者體內，影響消費者的健康。在生產中此類藥物的使用具有嚴格的限量標準，《中華人民共和國農業農村部公告235號》規定了地克珠利在雞肌肉中的最高殘留量為500 μg/kg，妥曲珠利在雞肌肉中的最高殘留量為100 μg/kg[2]。

目前對地克珠利和妥曲珠利的測定方法主要有液相色譜法[3-4]和液相色譜質譜聯用法[5-6]。液相色譜法存在較多缺陷，測定時各種化合物之間的干擾較大，造成各個目標峰的響應值相差很大。液相色譜質譜聯用法可以減少色譜峰干擾的問題。但是地克珠利和妥曲珠利類化合物的特征是碎片離子少，因此用液相色譜質譜聯用法測試該類化合物時，通常采用母離子的碎片信息定性定量。但母離子定性定量受基質效應的影響較大，造成測定結果發生偏差。高靈敏度且高選擇性的高分辨質譜技術將能夠大大避免這一弊端。木合他拜爾等[7]利用Q-Exactive技術測定了雞肉中地克珠利和妥曲珠利的殘留情況，取得了較低定量限的目標物質。但該方法的前處理過程對基質的凈化程度不夠，造成目標峰受到噪音效應干擾。本文對樣本的提取、凈化以及質譜條件進行了全面的優化，建立了具有高靈敏度和高選擇性的超高效液相色譜-串聯質譜法，同時快速準確、定性定量檢測了豬肉中地克珠利和妥曲珠利藥物。該方法操作簡便，能大大縮短檢測周期，靈敏度高且抗干擾能力強，這將為動物源性食品中地克珠利和妥曲珠利的快速檢測提供科學的依據和參考。

1 ?材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

本次試驗所用儀器為Aglient 1290超高效液相色譜儀、AB Sciex Triple QuadTM 5500 質譜儀（美國AB Sciex公司）、OAN-EVAP 24型全自動氮吹儀、TAITEC Mix-VR多管漩渦混合儀、梅特勒AG285型天平、IKAKS501型旋渦混合器、Sigma 3K15冷凍離心機、Millipor超純水儀、新芝SB-1200DT型超聲波清洗機和Waters PRIME HLB（6cc 200 mg）固相萃取柱。

1.1.2 藥品與試劑

乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）和甲酸（色譜純），乙腈水溶液中乙腈、水和甲酸的配比為80∶20∶0.2（體積比），復溶液中甲醇、水和甲酸的配比為10∶90∶0.09（體積比）。

標準物質地克珠利、妥曲珠利和氘代妥曲珠利均為德國Dr. Ehrenstorfer公司產品。

1.2 樣本制備

取適量新鮮豬肉組織，充分絞碎且均質，于-20 ℃避光保存。

1.3 標準儲備液和混合標準工作液的配制

準確稱取地克珠利、妥曲珠利和氘代妥曲珠利的標準品，用甲醇分別配成1.00 mg/mL的標準儲備液，于-18 ℃冰箱中保存。再分別移取適量地克珠利和妥曲珠利標準儲備液，用甲醇逐級稀釋成適當濃度的地克珠利和妥曲珠利混合標準工作液。

1.4 樣本前處理

稱取試樣2.50 g，置于50 mL離心管中，按加標水平添加標準液。加乙腈水溶液10 mL，在振蕩器上震蕩10 min，超聲提取5 min， ? 9 000 r/min離心6 min。移取3.5 mL上清液，直接過Waters PRIME HLB固相萃取柱（6cc，200 mg），保持1 s/滴的速度。用玻璃小管收集全部流出液，準確移出2.5 mL～15 mL帶刻度小管內。洗脫液在40 ℃水浴下氮氣吹至少于0.5 mL，殘留液用復溶液定容至1.00 mL，過0.22 μm濾膜后，進行液相色譜-串聯質譜測定。

1.5 超高效液相色譜-串聯質譜條件

1.5.1 超高效液相色譜條件

色譜柱：ACQUITYUPLC BEH C18（1.7 μm， 2.1 mm×100 mm）;流動相A相為0.1%甲酸水溶液;流動相B相為甲醇;柱溫為40 ℃;進樣量5.0 μL。梯度洗脫程序見表1。

1.5.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源;掃描方式：負離子掃描;檢測方式：多反應監測;電噴霧電壓：5 500 V;離子源溫度：600 ℃;氣簾氣壓力：28 psi;碰撞氣壓力：10 psi;霧化氣壓力：55 psi;輔助加熱氣壓力（GS2）：60 psi。

定性離子對、定量離子對、采集時間、去簇電壓及碰撞能量見表2，空白基質及添加藥物樣本色譜圖見圖1。

2 ?結果與討論

2.1 標準曲線

按方法條件設置儀器參數，精密量取地克珠利和妥曲珠利混合標準溶液以及氘代妥曲珠利標準溶液適量添加到空白豬肉中，制得地克珠利和妥曲珠利濃度分別為10.0 μg/kg、20.0 μg/kg、5.00 μg/kg、100 μg/kg、500 μg/kg各系列空白添加試樣，按1.4試驗方法處理試樣，樣液經過液相色譜串聯質譜測定，以添加藥物的濃度為橫坐標，樣本的峰面積為縱坐標繪制標準曲線，線性范圍、回歸方程和相關系數見表3，地克珠利和妥曲珠利基質試驗的線性范圍在10.0 μg/kg～ 500.0 μg/ kg內，各化合物峰面積與其相應濃度呈現良好的線性相關，相關系數（r）均在0.996以上。

2.2 方法檢出限確定

以空白豬肉樣本為基質，做7個平行添加試驗，地克珠利和妥曲珠利陽性添加濃度均為10.0 μg/kg，按照1.4所述的樣本前處理方法全過程進行預處理和測定，上機測得地克珠利含量X1：9.391 μg/kg、10.39 μg/kg、 ? ? ? ? ? ? ? ? ? 9.709 μg/kg、9.953μg/kg、9.246 μg/kg、9.718 μg/kg和9.399 μg/kg;測得妥曲珠利含量X2：9.450 μg/kg、9.051 μg/kg、9.516 μg/kg、9.327μg/kg、8.773 μg/kg、 8.600 μg/kg和8.944 μg/kg。根據各樣本檢測值計算出平均值X及標準偏差Sb，按公式檢出限=（k×Sb×C）/X （k為置信因子，一般取3）計算，計算出地克珠利和妥曲珠利方法檢出限分別為1.22 μg/kg和1.25μg/kg。

2.3 回收率測定

用空白豬肉試樣進行3個水平（10.0 μg/kg、50.0 μg/kg和500.0 μg/kg）的陽性添加回收試驗，每個水平建立6個平行樣本，按照1.4所述的樣本前處理方法全過程進行預處理和測定。地克珠利和妥曲珠利的回收率和范圍以及其相對標準偏差結果見表4。

表4回收率和相對標準偏差結果顯示，該方法的回收率較好，相對標準偏差較低，地克珠利的回收率范圍為81.4%～105.0%，相對標準偏差范圍為3.8%～6.2%;妥曲珠利的回收率范圍為86.0%～103.0%，相對標準偏差范圍為4.1%～5.9%。方法檢出限低、重復性好和回收率較好，可準確進行定性和定量檢測，并且受基質效應的干擾較小。

3 ?結論

本文建立了畜禽肉中地克珠利和妥曲珠利殘留量的超高效液相色譜-串聯質譜測定方法。方法采用乙腈水溶液提取，提取離心后直接過固相萃取小柱進行凈化，過柱的要求低，操作簡單。試驗結果表明，該方法檢出限低、回收率較好和靈敏度高;液相色譜串聯質譜的條件設置合理，相關參數優化較佳，該方法能有效消除基質效應的干擾，大大節約檢測時間和人力物力，從而進一步提高檢測的效率。多種食品樣本的實測試驗證明，本方法適用于動物肌肉組織中地克珠利和妥曲珠利的快速的定性定量檢測。□□

參考文獻：（7篇，略）