云南蠶區58個家蠶品種對家蠶質型多角體病毒的抗性調查及聚類分析

邵榆嵐，張一川，唐芬芬，張永紅，朱 峰，白興榮

(云南省農業科學院蠶桑蜜蜂研究所，云南 蒙自 661101)

【研究意義】家蠶質型多角體病毒(BombyxmoriCytoplasmic Polyhedrosis Virus，BmCPV)，基因組由10個dsRNA片段組成，屬呼腸孤病毒科(Reoviridae)[1-2]，能形成光學顯微鏡下可見的病毒多角體，其形態多樣，常見四角形、三角形等，而且大小不一。由該病毒感染引起的家蠶質型多角體病毒病成為云南蠶區重要家蠶病害之一，典型病癥是發病后期解剖病蠶能看見中腸后端乳白色褶皺，在生產上常見于5齡后期發病，給蠶農造成嚴重損失[3]。本研究利用云南蠶區保存的豐富家蠶品種資源，開展家蠶品種對家蠶質型多角體病毒的抗性調查和分析，為抗病育種、抗病關鍵基因的研究提供參考。【前人研究進展】黃君霆[4]，張遠能[5]，徐安英[6]等研究證明，家蠶不同品種對家蠶質型多角體病毒的抗性差異較大。渡部仁[7]認為家蠶對BmCPV的抵抗性主要是侵染抵抗性，在不同品種間存在不同基因控制，一般品種受微效多基因控制，高抗品種受一對顯性基因控制。段家龍[8]研究表明，家蠶個體、化性、性別、蛾區間對BmCPV抗性均存在差異。家蠶不同發育時期對BmCPV的感染抵抗性不同，起蠶感染率高，且受到桑葉品種的影響[9-10]。隨著分子水平的深入研究，采用高通量技術比較正常家蠶和BmCPV患病家蠶、抗BmCPV家蠶品種和感BmCPV家蠶品種，獲得許多差異表達基因，在蛋白質代謝、能量代謝等基因功能方面作用凸顯[11-13]，感染機制的深入研究為傳統抗病育種提供理論支撐。家蠶品種抗病性鑒定是抗病育種、抗病基因發掘的重要基礎，小麥[14]等物種上均采用此策略。針對家蠶質型多角體病毒病發病時外觀特征不明顯，潛伏期較長，容易二次感染等特點，在進行該病鑒定時常常采用早期診斷的方法。家蠶質型多角體病毒病的早期診斷有免疫對流電泳檢測、多角體鏡檢、體重變化測量等方法[15]。吳萍等[16]采用熒光定量PCR的方法，在接種后早期區別不同品種的抗性水平。陳克平[17]，徐安英[6]等家蠶品種對核型多角體病毒和質型多角體病毒的抗性水平分布，均采用多個濃度的半數致死濃度LC50值和半數感染濃度IC50值進行研究。【本研究切入點】首次采用聚類分析對家蠶品種抗病水平進行分類，聚類分析可以在沒有先驗分類的情況下通過觀察數據進行分類，它使組內的數據對象具有最高的相似度，而組間具有較大的差異性，在科學研究和生產實踐中應用廣泛[18]。【擬解決的關鍵問題】通過不同品種接種BmCPV后的感染率，采用方差分析、多重比較獲得不同品種對BmCPV的抗性差異，通過聚類分析把云南蠶區家蠶品種抗BmCPV能力劃分不同水平，為家蠶品種和家蠶質型多角體病毒相關的實驗提供重要參考，篩選高抗品種為抗病育種、抗病關鍵基因的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試品種由云南省農業科學院蠶桑蜜蜂研究所家蠶資源保存研究室提供，全部均為二化性品種，其中日系品種27個，中系品種31個。

1.2 試驗方法

1.2.1 家蠶質型多角體病毒懸液的準備 家蠶普種菁松×皓月常規飼養，4齡起蠶接種病毒，5齡后期出現空頭狀，蠶座出現白色糞便時收集發病蠶，解剖收集白色褶皺的中腸，滅菌水洗干凈，研磨，用3層紗布過濾，收集濾液。濾液用滅菌水稀釋，進行差速離心。高速6000 r/min，離心20 min，取出沉淀中的白色部分，其余沉淀加滅菌水混合振蕩后再用高速離心，反復高速離心取出白色沉淀部分收集，之后采用高速5000 r/min(離心10 min)和低速500 r/min(離心3 min)交叉離心。除去白色沉淀外層灰色部分和內部細小雜質，收集沉淀，加入少量滅菌水懸浮，得到高純高濃度的純白色病毒多角體液并于4℃保存。使用當天采用血球計數板測定病毒液濃度，制備成所需濃度的BmCPV病毒多角體液。

1.2.2 家蠶品種的BmCPV接種 供試家蠶品種于春季正常飼養至3齡起，接種當天采摘適齡新鮮桑葉，清洗干凈晾干后選擇無皺葉，切成4 cm×6 cm大小一致的方形葉，放入濃度1×107個/mL的BmCPV病毒多角體液，葉表面水分蒸發后，等量桑葉給3齡起蠶經口接種。每個品種每個重復飼養30頭健康蠶于帶蓋塑料盒中，每盒2片病毒桑葉，設3個重復。接種期防止桑葉凋萎，保證食盡桑葉，第2頓開始更換為普通新鮮桑葉正常飼養。

為防止二次感染，實驗期間，上午喂蠶前統計蠶數并去除殘葉蠶沙，更換墊紙和塑料盒，下午喂蠶前用新鮮生石灰粉消毒蠶體蠶座。每天喂蠶結束后用含1 %有效氯的漂白粉水消毒蠶室地面。

1.2.3 家蠶品種接種BmCPV后的感染率調查 接種后第7天，取每條蠶的中腸，顯微鏡檢測是否有BmCPV多角體，記錄感染數，并按下面公示計算感染率。為確保鏡檢準確率，區別多角體和脂肪球，鏡檢時每個樣品3個重復，其中一個樣品用0.5 %蘇丹Ⅲ染色液染色，多角體能夠被染成橘紅色，脂肪球不被染色，確定該蠶是否含有BmCPV多角體。

感染率(%)=感染數/供試蠶頭數×100

1.3 統計分析

實驗得到的感染數采用EXCEL進行數據統計；感染率的方差分析、多重比較等采用SAS 9.0進行數據分析；K-均值聚類、系統聚類采用SPSS 20.0進行分析。

2 結果與分析

2.1 58個品種接種BmCPV后的抗性差異

依據家蠶質型多角體病毒的一般發病規律，接種后第7天是病勢中期，此時調查感染數可減少二次感染的干擾。從表1可知，各品種所有數據表達為均值±標準差，95 %置信區間。對不同品種的感染率進行方差分析，由表2可知，其P值小于0.01顯著水平，說明有99 %的把握肯定不同品種的感染率差異顯著，其中79.34 %的品種符合。進而采用最小顯著性差異法(LSD)檢驗不同品種的感染率在各顯著水平的平均差異。感染率在0.05顯著水平，分為20個差異組，在0.01顯著水平，分為17個差異組，不同顯著水平均為品種14的感染率最低，品種10與品種14差異不顯著。

表1 58個品種接種BmCPV后的感染率

表2 感染率的方差分析(一)

表3 感染率的方差分析(二)

表4 58個品種感染率的多重比較

2.2 58個品種抗BmCPV能力的聚類分析

采用聚類分析中K-均值聚類和系統聚類，進一步對58個品種進行抗性分類。K-均值聚類自定義將聚類數分為4類，經過10次迭代，最終聚類中心和聚類成員如表5所示，第2類的感染率最低，為55.10 %，品種10和品種14屬于此類；第1類感染率最高，為96.22 %，有23個品種；第3類有17個品種，感染率均值為73.70 %；第4類感染率較高，為90.09 %，包括16個品種。由此可知，K-均值聚類中的第2類，品種10和品種14的抗BmCPV能力最好，品種名稱分別是秋白B、P50。采用系統聚類中Ward法，平方歐氏距離測量，譜系圖如圖1所示，分為兩大類，4個小類，其中品種5、品種16、品種29與品種10、品種14同為一類，通過系統類聚方法獲得高感染率品種為10個，比K-均值聚類方法獲得的高感染率品種減少13個。2種聚類方法結果得到的抗性分布如圖2所示，系統聚類的分布呈中間多，兩頭少的形態，比K-均值聚類的分布更加合理。

表5 K-Mean法聚類成員

圖1 58個品種抗BmCPV系統聚類譜系圖

a：K-均值聚類；b：系統聚類a：K - Mean cluster；b：The system cluster

3 討 論

近幾年，云南蠶區家蠶質型多角體病毒病發生率逐年提高，對該病的防治已刻不容緩。掌握蠶區家蠶品種對BmCPV的感染情況并獲知其抗性分類是防治該病的第一步。通過對感染率數據的方差分析和多重比較，云南蠶區不同品種抗病性差異顯著，但該方法不能直接對家蠶品種抗病性進行分類，而抗性分類在家蠶病理研究中對選擇供試品種具有重要的指導意義。對苦瓜種質資源白粉病抗性[19]、高粱品種萌發期抗旱性鑒定與分類[20]等研究表明，聚類分析是抗性分類的重要方法。本研究采用2種聚類方法進行比較，K-均值聚類法分為4類，快速直觀把58個家蠶品種分類；而在系統聚類中通過對組間鏈接法、重心法和ward法的數據比較和差異檢驗(過程略)，最終確定ward法的結果最好且差異最顯著。2種聚類方法的結果比較，系統聚類的分類結果更加合理，與預期相符，能夠在以后生物學實驗研究中以此為依據，選取與實驗目的相吻合的供試品種進行實驗。

4 結 論

(1)通過對不同家蠶品種接種相同濃度的BmCPV多角體病毒液，接種第7天后調查感染率。經方差分析和多重比較，不同品種對家蠶質型多角體病毒病抗病性差異顯著(P<0.01)。

(2)采用聚類分析方法確定家蠶品種資源對BmCPV的抗性分類。通過K-均值聚類和系統聚類的比較，供試品種采用系統聚類方法把BmCPV的抗性水平分為4類，高抗品種有5份，中抗品種23份，中感品種20份，高感品種10份，分別占供試品種材料總數的9 %、40 %、34 %、17 %。該結果對家蠶病理研究供試品種選擇、抗病素材選取提供參考，為抗病育種和抗病關鍵基因的研究奠定基礎。

(3)云南蠶區抗BmCPV最好的P50品種(原名大造)與段家龍[8]研究結果一致。