色素關鍵基因在山羊皮膚和B16-F10細胞增殖、分化階段的表達及相關性研究

蔣 婧，任航行，李 杰，王高富，陳燦燦，付 琳，張 麗，劉良佳，周 鵬*

(1．重慶市畜牧科學院，重慶 榮昌 402460；2．重慶市山羊工程技術研究中心，重慶 榮昌 402460；3.甘肅農業大學動物科技學院，甘肅 蘭州 730070)

【研究意義】酉州烏羊目前僅分布于重慶市酉陽縣，被當地人稱為“藥羊”，是重慶市特有的優良遺傳資源。該羊體格中小，除背脊線和兩眼圈為黑毛外，其余被毛均為白色，全身皮膚及眼、鼻、口、肛門、陰門等可視黏膜為烏色。項目組前期研究發現，100日齡酉州烏羊胎兒表皮和真皮組織中已含有較多黑色素顆粒，而同日齡渝東白山羊胎兒皮膚組織中則未檢測到，表明黑色素沉積是影響烏皮羊和非烏皮羊之間皮膚顏色差異的重要因素，而且在皮膚發育分化的早期，兩種羊黑色素細胞的遷移就可能存在差異[1]。皮膚表皮層的黑色素細胞，是由成黑素細胞分化而來，成黑素細胞則起源于神經外胚層的神經嵴細胞沿背側途徑遷移衍生[2]。黑色素由黑色素細胞內的黑色素小體產生，其形成受多條信號通路調控，在整個黑色素生成調控網絡中，包含很多重要的調控基因，其中ASIP、END3和PAX3等基因位于調控網絡的上游，對位于調控網絡下游的酪氨酸酶家族基因(TYR、TYR1和DCT)具有一定的調控作用[3-4]。【前人研究進展】ASIP通過抑制下游基因的表達水平或酶活性來抑制黑色素的生成，過表達ASIP可抑制真黑色素的減少而產生褐黑色素[5-6]。PAX3被認為在早期的神經嵴和黑色素細胞的發育分化中扮演重要角色，可通過激活下游基因來調控黑色素細胞的存活、增殖、遷移和分化，此外還參與了色素合成的代謝過程[7-8]。END3能有效促進成黑素細胞和黑色素細胞的存活、增殖、分化，以及調節黑色素細胞的色素合成[4,9]。TYR是黑色素合成過程中的限速酶，其活性的高低直接影響真黑色素和褐黑色素的生成[10]，TYRP1和DCT(TYRP2)屬于TYR家族的成員，直接參與真黑色素合成[3,11]，它們的活性和表達受上游基因的調控。【本研究切入點】目前，這6個與黑色素合成相關的重要基因是否在不同膚色山羊皮膚中存在表達差異、是否與山羊皮膚黑色素沉積有關尚不清楚。因此，本研究擬以酉州烏羊(白毛烏皮)、板角山羊(白毛白皮)和小鼠皮膚黑色素瘤細胞(B16-F10)為研究對象，檢測ASIP、EDN3、PAX3、TYR、TYRP1和DCT在成年烏皮與白皮羊皮膚組織、B16-F10增殖與分化階段的mRNA相對表達量，分別從體內和體外檢測這6個基因的表達情況，并進一步分析它們表達之間的相關性。【擬解決的關鍵問題】為進一步闡明山羊皮膚黑色素沉積的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料

成年酉州烏羊和板角山羊公羊(各3只)由重慶市酉州烏羊資源保護場提供，屠宰后采集皮膚組織，置于液氮罐帶回實驗室，-80 ℃保存備用。B16-F10細胞購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 主要試劑

DMEM培養基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、馬血清(horse serum，HS)、青鏈霉素和0.25 %胰酶均購自美國Gibco公司。Transcriptor First Strand cDNA Synthesis和FastStart Universal SYBR Green Master (ROX)均購自德國Roche公司。Trizol試劑購自美國Invitrogen公司。

1.3 B16-F10細胞培養

B16-F10細胞增殖培養：將液氮保存的B16-F10復蘇于10 cm細胞培養皿中，當細胞融合度達到90 %時進行傳代。吸棄培養基，PBS洗3遍；0.25 %胰酶消化，當細胞出現回縮、脫落時，10 % FBS的DMEM培養基終止胰酶消化；1000 r/min，離心2 min，棄上清，加入10 mL含10 % FBS的DMEM完全培養基，吹打均勻；接種到6孔板中，于37 ℃，5 % CO2培養箱中繼續培養，隔天更換一次培養基，分別于接種后1、3、5和7 d收集細胞。

B16細胞分化培養步驟：培養于在6孔板的B16細胞當細胞融合度約80 %左右時更換為含2 %馬血清的DMEM培養基進行誘導分化，隔天更換一次培養基。分別在分化后1、3、5和7 d收集細胞。

1.4 總RNA提取和cDNA合成

用Trizol法提取酉州烏羊和板角山羊皮膚組織、B16-F10細胞增殖與分化階段細胞的總RNA，1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質量，核酸蛋白儀測量總RNA濃度。cDNA合成按照反轉錄試劑盒(Transcriptor First Strand cDNA Synthesis)說明書進行。

1.5 實時熒光定量PCR檢測各基因mRNA表達

采用實時熒光定量PCR的方法，檢測ASIP、EDN3、PAX3、TYR、TYRP1和DCT基因在不同膚色山羊皮膚組織和B16-F10細胞增殖與分化階段的mRNA表達情況。反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性10 s，退火溫度退火60 s，40個循環；每個基因重復3次。β-actin為內參基因，引物信息見表1。相對表達量的結果采用2-△△Ct法進行計算。

1.6 數據處理

應用IBM SPSS Statistics 22統計軟件進行分析，組間方差分析和顯著性檢驗利用獨立樣本t檢驗進行比較；各基因表達的相關性利用雙變量Pearson檢驗。試驗數據以“平均值±標準差”表示，**表示差異(或相關性)極顯著(P<0.01)，*表示差異(或相關性)顯著(P<0.05)。

表1 基因引物參數

2 結果與分析

2.1 酉州烏羊與板角山羊皮膚黑色素合成相關基因的表達及相關性分析

qRT-PCR檢測了ASIP、EDN3、PAX3、TYR、TYRP1和DCT基因在不同膚色山羊皮膚中的mRNA相對表達量，結果(圖1)顯示，ASIP在酉州烏羊皮膚中的表達極顯著低于板角山羊(P<0.01)，TYRP1和DCT在酉州烏羊皮膚中的表達極顯著高于板角山羊(P<0.01)，PAX3、TYR在酉州烏羊皮膚中的表達顯著高于板角山羊(P<0.05)，EDN3在酉州烏羊皮膚中的表達略高于板角山羊，差異不顯著(P>0.05)。

如表2所示，ASIP與TYRP1和DCT呈極顯著的負相關(P<0.01)。EDN3與ASIP、PAX3、TYR、TYRP1和DCT相關性均不顯著(P>0.05)。PAX3與TYR和TYRP1呈極顯著正相關(P<0.01)。TYRP1、TYR、DCT兩兩之間呈極顯著正相關(P<0.01)。

2.2 黑色素合成相關基因在B16-F10細胞增殖階段的動態表達及相關性分析

如圖2所示，ASIP、TYRP1和DCT表達均呈先上升后下降的趨勢，均在3 d極顯著高于1 d(P<0.01)；EDN3表達與ASIP和TYRP1相似，在7 d極顯著低于1 d(P<0.01)；PAX3與TYR表達模式相似，均在增殖階段后期高于前期，且在7 d極顯著高于1 d(P<0.01)。暗示它們在色素細胞增殖過程中發揮不同的調節作用。

**表示差異極顯著(P<0.01)，*表示差異顯著(P<0.05)** indicates the extremely significant difference (P<0.01), and * indicates significant difference (P<0.05)

各基因在B16-F10細胞增殖階段表達的相關性(表3)顯示，ASIP與TYRP1和DCT均呈極顯著的正相關(P<0.01)，與PAX3呈極顯著負相關(P<0.01)，與EDN3呈顯著正相關(P<0.05)；PAX3與TYRP1呈極顯著負相關(P<0.01)，與TYR呈極顯著正相關(P<0.01)；TYRP1和DCT呈極顯著的正相關(P<0.01)；其它各基因間相互不顯著相關(P>0.05)。

表2 各基因在不同膚色山羊皮膚組織中的表達的相關系數

注：**表示2個基因表達呈極顯著相關(P<0.01)，*表示2個基因表達呈顯著相關(P<0.05)。

Note: ** indicates the extremely significant correlation between two genes (P<0.01), and * indicates significant correlation between two genes (P<0.05).

A～F分別表示ASIP、EDN3、PAX3、TYR、TYRP1、DCT在B16-F10細胞增殖階段的mRNA相對表達量；與1 d相比，**表示差異極顯著(P<0.01)，*表示差異顯著(P<0.05)A-F indicated mRNA relative expression levels of ASIP, EDN3, PAX3, TYR, TYRP1 and DCT in the proliferation phase of B16-F10 cells; ** indicates the extremely significant difference (P<0.01), and * indicates significant difference (P<0.05), compared with 1 day

2.3 各基因在B16-F10細胞分化階段的動態表達及相關性分析

各基因在B16-F10細胞分化階段的mRNA表達情況如圖3所示，ASIP與TYR和DCT具有相似的表達模式，均在3 d的相對表達量最高，其中TYR在3 d的相對表達量顯著高于1 d(P<0.05)，DCT則在后面3 d的相對表達量均極顯著高于1 d(P<0.01)，而ASIP在7 d的相對表達量顯著低于1 d(P<0.05)；PAX3和TYRP1表達在整個分化階段呈持續下降趨勢，均在5和7 d極顯著低于1 d(P<0.01)。

各基因在B16-F10細胞分化階段表達的相關性(表4)顯示，ASIP與TYRP1均呈極顯著的正相關(P<0.01)，與TYR和DCT呈顯著正相關(P<0.05)；PAX3與TYRP1呈極顯著正相關(P<0.01)，與DCT呈極顯著負相關(P<0.01)；TYR與DCT呈極顯著的正相關(P<0.01)，與TYRP1呈顯著正相關(P<0.05)；其它各基因間相互不顯著相關(P>0.05)。

3 討 論

動物毛色、膚色的形成主要取決于黑色素細胞中合成的真黑色素與褐黑色素的比例，真黑色素比例偏高時，表現出黑色或褐色，相反則表現出白色、黃色或紅棕色[12]。TYR正是控制這2種色素合成比例的限速酶，當其活性高時，真黑色素合成比例偏高，反之褐黑色素偏高[12-13]。TYRP1和DCT有很高的同源性，促使真黑色素生成并使TYR的活性保持穩定[14]。本研究檢測到TYR在酉州烏羊皮膚中的表達顯著高于板角山羊，TYRP1和DCT在酉州烏羊皮膚組織中的表達極顯著高于板角山羊，說明TYR、TYRP1和DCT的高表達對酉州烏羊皮膚真黑色素沉積有促進作用，前人在深色被毛和淺色被毛動物上的研究也得到類似的結果[15-18]。國內外學者研究發現，ASIP基因在深色被毛個體中表達量低于白色被毛個體[19-20]，并推測是由于ASIP抑制TYRP1和DCT基因的表達和翻譯，顯著降低TYR的酶活性造成的。本研究發現成年酉州烏羊皮膚組織中的ASIP基因極顯著低于板角山羊，且與TYRP1和DCTmRNA表達呈極顯著負相關，與前人研究結果相符，說明ASIP可能通過間接調控TYRP1和DCTmRNA表達水平來抑制酉州烏羊皮膚的真黑色素沉積。此外，本研究還發現，PAX3在酉州烏羊皮膚中表達顯著高于板角山羊，與TYR和TYRP1的mRNA表達極顯著正相關，暗示PAX3高表達與酉州烏羊皮膚真黑色素沉積表型密切相關。

表3 各基因在B16-F10細胞增殖階段表達的相關系數

注：**表示2個基因mRNA表達呈極顯著相關(P<0.01)，*表示2個基因mRNA表達呈顯著相關(P<0.05)。

Note: ** indicates the extremely significant correlation between mRNA expression of two genes (P<0.01), and * indicates significant correlation between mRNA expression of two genes (P<0.05).

A～F分別表示ASIP、EDN3、PAX3、TYR、TYRP1、DCT在B16-F10細胞分化階段的mRNA相對表達量；與1 d相比，**表示差異極顯著(P<0.01)，*表示差異顯著(P<0.05)A-F indicated mRNA relative expression levels of ASIP, EDN3, PAX3, TYR, TYRP1 and DCT in the differentiation phase of B16-F10 cells; ** indicate the extremely significant difference (P<0.01), and * indicates significant difference (P<0.05), compared with 1 day

表4 各基因在B16-F10細胞分化階段mRNA表達的相關系數r

注：**表示兩個基因表達呈極顯著相關(P<0.01)，*表示兩個基因表達呈顯著相關(P<0.05)。

Note: ** indicates the extremely significant correlation between two genes (P<0.01), and * indicates significant correlation between two genes (P<0.05).

酪氨酸酶基因家族(TYR)包括TYR與TYRP1、DCT3個基因，其中TYRP1、DCT基因均來源于TYR基因的自我復制和變異，雖然它們的外顯子個數不一樣，但它們編碼的蛋白質一級結構相似，且均在黑色素生成過程中發揮重要作用[11, 21]。黑素小體是生成黑色素的細胞器，在其發育前期，黑色素還未生成時，TYR酶活性較高，隨著黑色素的慢慢沉積，TYR酶活性逐漸降低，當黑素小體完全充滿了黑色素時，TYR酶活性也完全失去[22]。本研究在B16-F10細胞增殖階段，檢測到TYRmRNA表達隨著增殖時間的增加而增加，在細胞分化前期，TYRmRNA表達呈上升趨勢，到分化3 d，其相對表達量達到最高，隨后下降，在分化7 d達到一個較低值。說明B16-F10細胞在增殖階段，只是細胞數量上在發生變化，而未生成黑色素；在分化階段前期，大量黑素小體處于發育前期，到分化階段后期，隨著黑色素顆粒的增多，越來越多的黑素小體進入發育后期，TYR的表達及活性也隨之降低。TYRP1和DCT分別與TYRmRNA表達在B16-F10細胞分化階段呈顯著和極顯著正相關，但在增殖階段相關性不顯著，說明TYRP1和DCT只在黑色素生成過程中對維持TYR活性的穩定具有一定的功能，這與TYRP1和DCT只參與真黑色素生物合成的理論相符。本研究檢測到PAX3表達在B10-F10細胞增殖階段后期極顯著高于前期，說明PAX3確實在早期黑色素細胞發育中扮演重要的角色。而隨著B10-F10細胞誘導分化時間的增加，PAX3基因表達呈持續降低的趨勢，說明PAX3參與了色素合成的代謝過程，且與前人認為PAX3表達顯著下調是B16細胞分化并產生黑色素的重要前提條件相符[1]。

綜上所述，TYR直接參與山羊皮膚和B16-F10細胞真黑色素的合成過程，其高表達能促進真黑色素的生成，影響酉州烏羊皮膚黑色素沉積。TYRP1和DCT只在真黑色素合成過程對維持TYR表達有作用，從而間接對酉州烏羊皮膚黑色素沉積具有促進作用。ASIP對TYRP1和DCT表達具有負調控作用，低表達ASIP促進了酉州烏羊皮膚黑色素的沉積。PAX3表達顯著下調是黑色素瘤細胞分化并產生黑色素重要前提條件，但其高表達能促進黑色素細胞的發育與增殖，所以在酉州烏羊皮膚中，PAX3可能通過促進黑色素細胞數量的增多來促進黑色素的沉積。本研究結果還暗示，EDN3可能不是導致板角山羊與酉州烏羊皮膚黑色素沉積差異的關鍵基因。這些研究結果為將來進一步闡明酉州烏羊皮膚黑色素沉積的分子機制提供基礎資料。但黑色素生成過程太過復雜，現在的研究還只是冰山一角，是否還存在其他通路的調控尚未清楚，且每個基因是否還參與調控其他性狀的信號通路也不清楚，有待進一步研究。

4 結 論

TYR、TYRP1和DCT基因高表達能促進真黑色素的生成，影響酉州烏羊皮膚黑色素沉積。PAX3可能通過促進黑色素細胞數量的增多來促進皮膚黑色素的沉積。ASIP對TYRP1和DCT表達具有負調控作用，低表達ASIP促進了酉州烏羊皮膚黑色素的沉積。EDN3可能不是導致板角山羊與酉州烏羊皮膚黑色素沉積差異的關鍵基因。