大鯢抗菌肽家族基因對弗氏檸檬酸桿菌侵染的表達調控

王 慧，白 禹，楊文佳，李國勇，駱建林，曹 禹，李 燦

(貴陽學院貴州省大鯢可持續利用協同創新中心，貴州省山地珍稀動物與經濟昆蟲重點實驗室，貴州 貴陽 550005)

【研究意義】近年來，大鯢(Andriasdavidianus)細菌性病害頻發，特別是弗氏檸檬酸桿菌引起的敗血癥[1]。抗菌肽分布于大鯢多個組織器官，在免疫系統中發揮重要的作用，研究抗菌肽家族基因在病原菌侵染大鯢時的表達響應，對揭示分子層面的互作機制和控制疾病具有重要意義[2-4]。【前人研究進展】大鯢屬于有尾目(Caudata)隱鰓鯢科(Cryptobranchidae)大鯢屬(Andrias)，是目前現存兩棲動物中個體最大，最珍貴的物種，被國家認定為二級野生保護動物。1978年，大鯢首次人工繁殖成功后，其人工養殖規模逐漸加大，貴州是大鯢人工養殖和繁育的主要地區之一，但大鯢在生長發育過程中受細菌、病毒和寄生蟲的危害，導致多種疾病發生，特別是弗氏檸檬酸桿菌，導致幼鯢發病，患病大鯢出現不良或拒食等癥狀，后期出現頭部、腹部腫大，皮下出血，最終死亡，會造成嚴重的經濟損失。抗菌肽(Antimicrobial peptide，AMPs)是機體免疫防御外界微生物入侵的重要屏障，具有廣譜抗菌、強堿性等一系列特點。抗菌肽與細菌侵染的作用機制是抗菌肽直接作用于細菌的膜上，并形成跨膜的離子通道，造成細菌細胞內容物泄露，從而導致細菌死亡，達到防御細菌侵染，發揮機體免疫的作用[5-6]。【本研究切入點】目前，研究抗菌肽與細菌互作機制主要集中在蛙類、魚類等，大鯢抗菌肽與細菌的作用機制研究較少，特別是研究抗菌肽基因在細菌侵染后的表達響應及調控更少。【擬解決的關鍵問題】2017年12月至2018年7月筆者在貴陽學院生命科學與資源環境學院，從大鯢不同組織部位對抗菌肽家族基因響應弗氏檸檬酸桿菌侵染入手，在不同時間檢測基因的表達量變化，揭示大鯢抗菌肽與細菌的互作機制提供理論依據，為養殖實踐中大鯢的免疫防御提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 弗氏檸檬酸桿菌與大鯢幼苗 弗氏檸檬酸桿菌，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。大鯢幼苗，購自貴州省翔盛大鯢繁養有限責任公司。

1.1.2 主要試劑 RNA提取試劑盒，購自北京全式金試劑有限公司；cDNA反轉錄試劑盒，購自TAKARA公司；SYBR Green PCR Master Mix試劑盒，購自北京全式金試劑有限公司。

1.1.3 儀器 BIO-RAD Gel DOCTM型凝膠成像儀，雪科IMS-130全自動雪花制冰機，Thermo 900 series超低溫冰箱，BIO-GEN MIlli-Qirect 16 超純水儀，博訊SW-CJ-1FD垂直超凈工作臺，RAY LEIGH UV18-01分光光度計。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的配制 將弗氏檸檬酸桿菌接種于LB平板上，37 ℃培養24 h后接種于LB液體培養基中，37 ℃搖床培養24 h，使用紫外分光光度計檢測OD600=0.6，濃度為1×108CFU/mL。

1.2.2 大鯢病原菌接種試驗 供試大鯢250～300 g，分為4組，每組15尾，暫養1周后無任何病變可用于接種試驗。第1組為對照組，接種1×PBS 0.5 mL/尾，第2組接種弗氏檸檬酸桿菌0.5 mL/尾。接種后0、12、24、36、48 h，分別從對照組和試驗組中各取3尾大鯢，無菌解剖后取皮膚、肝臟和脾臟組織速凍于液氮中備用[7]。

1.2.3 RNA提取與cDNA的合成 凍存組織采用Trizol抽提總RNA，步驟參照Trizol試劑盒說明書。提取后用1 %瓊脂糖凝膠電泳電泳25 min，檢測總RNA質量；用核酸蛋白儀(Eppendorf)檢測總RNA的濃度，OD260/OD280值在1.8～2.0為合格樣品。反轉錄使用反轉錄試劑盒RT reagent Kit (perfect Real Time，Takara)進行。反轉錄過程中向樣品總RNA中加入1 μl DNA-Eraser后置于PCR儀中42 ℃、2 min。隨后，加入反轉錄復合物和引物進行混合，混合終體積為10 μl，樣品混勻后在PCR儀37 ℃、15 min，85 ℃、5 s進行反轉錄。cDNA反轉后儲存在-20 ℃冰箱，保存待用。

1.2.4 RT-PCR qRT-PCR采用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒，在Bio-rad CXF96熒光定量PCR儀上進行反應，步驟參照說明書，引物序列見表1。反應體系20 μl：SYBR Green PCR Mix 10 μl，上下游引物各1 μl(濃度為10 μmol/L)，cDNA模板1 μl，ddH2O 7 μl。反應條件：95 ℃預變性 2 min；95 ℃變性 15 s；55 ℃退火延伸15 s，共40個循環；65 ℃采集熒光信號。每個樣品重復3次[8]。

1.3 統計分析

不同時間點相關基因的表達量采用2-△△Ct法，基因的相對表達量=處理樣品(目的基因CT值-actinCT值)-0 h樣品(目的基因CT值-actinCT值)。用SPSS 17.0統計軟件中單因素方差分析對數據進行統計學分析，P<0.05表示差異顯著；用軟件SigmaPlot 12.5制圖。

2 結果與分析

表1 qRT- PCR的檢測基因和內參基因引物序列

Table 1 qPCR primer sequences of tested genes and internal reference genes

基因名稱 Gene name引物序列(5′-3′) Primer sequenceAdCath 1F:TCAGTTCAGCCCAGGAAACTR:GGCACACGGTCTCTTTGATTAdCath 5F:CATGGCATCGGTTATTGACAR:CGCACTCTTCAGGGTTTCTCAdCath 8F:ACTCTGGCACAGGAGGAAGAR:GAGGCAGTGCGTGATAGTGARPL13F:CCATGGTGGCTAAGCAAGTTR:TGTGAGGCAGCATACCTCTGEF1-αF:GGACAGACCCGTGAACATGCR:CTTCCTTAGTGATCTCCTCGTAGC

注：AdCath1，AdCath5，AdCath8為課題組前期分析大鯢轉錄組數據，對比后獲得的抗菌肽家族基因。

Note:AdCath1,AdCath5, andAdCath8are the research group's pre-analytic data ofA.davidianustranscriptome, and the antibacterial peptide family genes are obtained after comparison.

圖1 大鯢總RNA電泳檢測圖譜

2.1 RNA質量

對大鯢皮膚，肝臟和脾臟抽提的RNA質量進行檢測，清晰可見RNA的2條主帶28SrRNA和18SrRNA(圖1)，表明提取的總RNA分子完整性好，可以用于下一步試驗。

2.2 大鯢皮膚組織抗菌肽家族基因對弗氏檸檬酸桿菌的響應表達

從圖2看出，在大鯢皮膚組織中抗菌肽基因AdCath1、AdCath5、AdCath8在不同時間點均有表達，其中，AdCath1表達量在12～48 h相較于0 h表達上調，且與對照組(1×PBS)相比，弗氏檸檬酸桿菌處理上調顯著，在36 h時AdCath1表達量是對照的92.35倍。AdCath5 在24～48 h弗氏檸檬酸桿菌處理的表達顯著高于對照，但12 h時顯著低于對照，表明AdCath5 對弗氏檸檬酸桿菌處理積極響應調控，24 h時響應更明顯。AdCath8在不同時間點均積極響應表達調控，在36 h時弗氏檸檬酸桿菌處理的表達量顯著高于對照18.58倍。

2.3 大鯢肝臟組織抗菌肽家族基因對弗氏檸檬酸桿菌的響應表達

從圖3看出，在大鯢肝臟組織中抗菌肽基因AdCath1、AdCath5、AdCath8在不同時間點均有表達，其中，AdCath1表達量在12～48 h相較于0 h表達上調，與對照相比，弗氏檸檬酸桿菌處理的上調顯著，且隨著時間延長表達量逐漸升高，在48 h時表達量是對照的52.99倍。AdCath5在24～48 h弗氏檸檬酸桿菌處理的表達顯著高于對照組，在24 h時表達量是對照的5.53倍，表明AdCath5對弗氏檸檬酸桿菌積極響應調控。AdCath8在不同時間點積極響應表達調控，隨著時間延長表達量上調更明顯，在48 h弗氏檸檬酸桿菌處理的表達量是對照的7.38倍。

2.4 大鯢脾臟組織抗菌肽家族基因對弗氏檸檬酸桿菌的響應表達

從圖4看出，在大鯢脾臟組織中抗菌肽基因AdCath1、AdCath5、AdCath8在不同時間點均有表達，其中AdCath1和AdCath8在12～48 h相較于0 h表達量上調，與對照組相比，弗氏檸檬酸桿菌處理的上調顯著，在24 h時表達量上調最明顯，分別是對照組的5.70和8.06倍。AdCath5在48 h時表達量最高，弗氏檸檬酸桿菌處理的表達量是對照組的2.61倍，24 h時是對照組的8.00倍。

圖2 大鯢抗菌肽基因AdCath 1、AdCath 5和AdCath 8不同時間點皮膚相對表達量

圖3 大鯢抗菌肽基因AdCath 1、AdCath 5和AdCath 8不同時間點肝臟相對表達量

圖4 大鯢抗菌肽基因AdCath 1、AdCath 5和AdCath 8不同時間點脾臟相對表達量

3 討 論

抗菌肽具有廣譜的抗菌性，且活性較高，如一種抗菌肽可抑制和殺死多種致病病菌，包括革蘭氏陽性菌(G+)和革蘭氏陰性菌(G-)[9-10]。因此，從抗菌肽的分子水平入手，通過轉錄組測序獲得大鯢抗菌肽家族3個基因(AdCath1、AdCath5、AdCath8)的全長，研究其與病原菌互作過程中發揮的作用。檸檬酸桿菌是一種革蘭氏陰性菌(G-)，可侵染大鯢，誘發病害及死亡，對大鯢資源保護及馴養繁殖造成嚴重的危害，研究檸檬酸桿菌與抗菌肽互作的分子機制迫在眉睫。

qRT-PCR方法廣泛應用于分子生物學領域，且具有檢測快速、高靈敏度檢出等特點。通過qRT-PCR方法分析弗氏檸檬酸桿菌侵染不同時間點大鯢3個抗菌肽家族基因的響應，使用熒光嵌合法，對抗菌肽基因的表達量進行準確監測，檢測方法簡單快速，且國內外多篇文獻均使用此方法進行基因表達分析[11]。結果表明，抗菌肽家族基因AdCath1、AdCath5、AdCath8在弗氏檸檬酸桿菌誘導后，不同時間點表達量均呈現上調趨勢，且均高于1×PBS處理后的表達量，表明抗菌肽家族3個基因積極響應弗氏檸檬酸桿菌的侵染，對病原菌的侵染作出積極的調控。

大鯢人工養殖業發展已有幾十年，但是涉及病害的研究較少，目前大鯢病害的研究主要集中在虹彩病毒引發的潰爛和出血等[12]，細菌病研究較少，特別是分子水平的研究。因此，從抗菌肽家族基因的分子機制出發，研究在細菌與寄主(大鯢)互作中抗菌肽基因的調控。目前，抗菌肽功能的研發已經成為科學研究的熱點之一，如新藥的開發，在轉基因動物中的應用，在飼料中添加抗菌肽作為抑菌劑等。此研究可進一步彌補大鯢抗菌肽研究的空白，為病原菌和大鯢的互作機制提供理論依據。

4 結 論

抗菌肽家族基因AdCath1、AdCath5、AdCath8在弗氏檸檬酸桿菌侵染大鯢的不同時間點均發揮著積極的調控作用，呈現表達上調的普遍趨勢，表明抗菌肽家族基因在病害侵染中起著積極的免疫作用。研究結果為大鯢抗病研究機制中抗菌肽的開發和應用奠定了理論基礎。