西藏3種冷水魚皮膚病灶中潛在病原微生物分析

陳美群，潘瑛子，牟振波，劉海平，周建設，王萬良，曾本和，扎西拉姆

(西藏自治區農牧科學院水產科學研究所，西藏 拉薩 850032)

【研究意義】黑斑原鮡、異齒裂腹魚和拉薩裸裂尻是西藏地區重要的冷水性經濟魚類，主要分布于雅魯藏布江中、上游的干支流及附屬水域，多在水質清澈、礫石底質的河道營底棲生活[1]。由于西藏冷水魚生長緩慢、性成熟較晚、繁殖力較低、種群數量較少、外來魚種入侵等因素導致其資源量逐年枯竭[2-3]，特別是黑斑原鮡等多種冷水魚的資源現狀已經非常嚴峻，已成為極度瀕危魚類，積極開展西藏冷水魚資源的研究與保護迫在眉睫。【前人研究進展】目前，黑斑原鮡、異齒裂腹魚和拉薩裸裂尻的研究主要集中在分類學[4]、食性組成[5]、胚胎發育特征[6-7]、生長繁殖特性[8]等方面，但有關冷水魚病原微生物的研究卻鮮有涉及，僅本課題組利用Illumina-Miseq高通量測序技術對黑斑原鮡和尖裸鯉開展了健康個體與病變死亡個體的表皮皮膚粘液及腸道內容物的微生物多樣性探討，研究表明細菌和真菌的群落結構變化是黑斑原鮡和尖裸鯉病變死亡的主要原因之一[9-10]。【本研究切入點】本文通過平板法對黑斑原鮡、異齒裂腹魚和拉薩裸裂尻等3種冷水魚皮膚病灶部位中多種可培養微生物進行了分離鑒定。【擬解決的關鍵問題】以期明確引起上述冷水魚皮膚病變死亡的主要病原微生物種類，為雅魯藏布江流域冷水魚微生物傳染病的防控與治療提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 試驗樣品采集及患病魚的臨床癥狀 黑斑原鮡[體重：(153±0.4)g，體長：(24.6±0.2)cm，樣品編號1]、異齒裂腹魚[體重：(1232.4±0.3)g，體長：(53.7±0.5)cm，樣品編號2]和拉薩裸裂尻[體重：(272.7±0.5)g，體長：(36.3±0.4)cm，樣品編號3]均為西藏自治區農牧科學院水產科學研究所于2017年在西藏拉薩國家農業科技園區養殖基地人工養殖過程中的患病魚，在采集樣品前對患病魚的臨床癥狀進行了觀察和記錄，黑斑原鮡、異齒裂腹魚和拉薩裸裂尻皮膚病灶部位病變主要表現為皮膚充血潰爛、有白灰色斑塊、附著有白色絨毛狀霉菌(圖1)。待上述馴養冷水魚死亡后2 h之內用無菌方式采集每種5尾死亡魚類皮膚病灶部位樣品，于實驗室6 h之內處理完畢。

圖1 冷水魚皮膚病灶部位

1.1.2 培養基 NA培養基：蛋白胨 5.0 g，葡萄糖 2.5 g，瓊脂 18.0 g，pH 7.0±0.1，蒸餾水定容至 1000 mL；TSA培養基：胰蛋白胨 15 g，大豆蛋白胨 5 g，氯化鈉 5g，瓊脂 15 g，pH 7.3±0.2，蒸餾水定容至 1000 mL；LB固體培養基：酵母提取物 5 g，胰蛋白胨 10 g，氯化鈉 10 g，pH值7.0±0.2，蒸餾水定容至 1000 mL；PDA培養基：馬鈴薯 300 g，葡萄糖 20g，瓊脂 15 g，氯霉素 0.1 g，pH值自然，蒸餾水定容至 1000 mL；孟加拉紅培養基：蛋白胨 5 g，葡萄糖 10 g，磷酸二氫鉀 1 g，硫酸鎂 0.5 g，瓊脂 15 g，孟加拉紅 0.03 g，氯霉素 0.1 g，pH 7.2±0.2，蒸餾水定容至 1000 mL。

1.2 病灶部位細菌和真菌的分離純化[11]

將患病魚體放于滅菌不銹鋼方盤中，用75 %滅菌酒精沖洗病灶部位15 s、重復3次，然后再用滅菌水沖洗病灶部位15 s、重復3次，最后用滅菌手術刀刮取病灶部位皮膚樣品，取5 g病灶部位樣品剪碎加入25 mL無菌水150 r/min震蕩30 min，取100 μl上清液均勻涂布于細菌分離培養基(NA、TSA)上、每種培養基設3個重復，細菌于15 ℃培養24 h后挑取形態不同的菌落反復劃線于LB固體培養基上直至獲得純培養物，細菌純培養物于LB斜面培養基上4 ℃保藏備用；取100 μl上清液均勻于真菌分離培養基(PDA、孟加拉紅培養基)上、每種培養基設3個重復，真菌于15 ℃培養7 d后挑取形態不同的菌落邊緣反復點接于PDA培養基上直至獲得純培養物，真菌純培養物于PDA斜面培養基上4 ℃保藏備用。

1.3 細菌和真菌的鑒定

形態學鑒定：細菌形態學鑒定參考《Taxonomic outline of the prokaryotes bergey’s manual of systematic bacteriology, 2nd edition》[12]、真菌形態學鑒定參考《真菌鑒定手冊》[13]；分子生物學鑒定：純培養物使用TIANGEN公司基因組抽提試劑盒提取總 DNA，然后用于目的基因的擴增。細菌16S rDNA目的基因PCR擴增采用通用引物27F/1492R[14]，真菌ITS區目的基因PCR擴增采用通用引物 ITS1/ITS4[15]。擴增程序如下：94 ℃ 5 min；94℃ 30s， 55 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min， 30 個循環；72 ℃ 10 min。取 2 μl PCR 產物，1 % 瓊脂糖電泳進行產物檢測。擴增產物送交北京億明復興生物科技有限公司測序，利用 BLAST 軟件將測定得到的基因序列與NCBI 數據庫進行序列比對分析，獲取NCBI 數據庫中相近菌株的基因序列，然后用 CLUSTAL X 軟件進行全序列比對，利用 MEGA 7.0中的鄰接法(Neighbor-Joining)建立目的基因的系統發育樹[16]。

表1 冷水魚病灶部位微生物平板分離

2 結果與分析

2.1 患病魚病灶部位微生物的分離

由表1可知，從3種冷水魚病灶部位共計分離得到151株細菌和72株真菌，其中黑斑原鮡病灶部位分離得到39株細菌和9株真菌、異齒裂腹魚病灶部位分離得到71株細菌和45株真菌、拉薩裸裂尻病灶部位分離得到41株細菌和18株真菌。所有分離得到的微生物經過形態學初步鑒定，篩重后選取33株細菌和54株真菌進行分子生物學鑒定。

2.2 冷水魚細菌16s rDNA序列的鑒定

由表2可知，對共計33株細菌進行了分子生物學鑒定，結果發現：分離自西藏3種冷水魚病灶部位的細菌主要分布在α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、β-變形菌綱(Betaproteobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、黃桿菌綱(Flavobacteria)、放線菌綱(Actinobacteria)、異常球菌綱(Deinococci)、芽孢桿菌綱(Bacilli)及厚壁菌門(Firmicutes)。西藏3種冷水魚病灶部位細菌主要有氣單胞菌屬(Aeromonas)、不動細菌屬(Acinetobacter)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium)、微球菌屬(Micrococcus)、紫色桿菌屬(Janthinobacterium)、微桿菌屬(Microbacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鄰單胞菌屬(Plesiomonas)、異常球菌屬(Deinococcus)、莫拉克斯氏菌屬(Moraxella)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、微小桿菌屬(Exiguobacterium)、沙雷氏菌屬(Serratia)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)、節細菌屬(Arthrobacter)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、考克氏菌屬(Kocuria)、馬賽菌屬(Massilia)、乳球菌屬(Lactococcus)、Deefgea和Paenisporosarcina等21屬。序列BLAST比對及系統進化分析結果表明(圖2)： 1-X-1、3-X-11、3-X-15、3-X-19等菌株與AeromonashydrophilaSAS13(MF612172.1 )具有99 %的同源性，Aeromonashydrophila是魚類常見的條件致病菌，典型的人-獸-魚共患病病原菌，可引起魚類爛腮病、赤皮病、出血病及紅鰭病等多種疾病[17]。1-X-21與Paenisporosarcinasp. ARK-14-voll(HF912842.1)具有100 %的同源性，Paenisporosarcina屬細菌是Krishnamurthi S等[18]2009年對Sporosarcina屬細菌重新分類而鑒別的一個細菌新屬。1-X-22、1-X-32與Chryseobacterium屬細菌具有較高的同源性，Chryseobacterium是一個新近命名的菌屬，由原先屬于黃桿菌屬的6個種和3個新種構成，Chryseobacteriumpiscicola由Ilardi P等[19]從芬蘭養殖場生病的大西洋鮭皮膚病灶中分離得到，是大西洋鮭的主要致病微生物。2-X-8、3-X-9與Pseudomonas屬具有100 %的同源性，Pseudomonas屬微生物是魚類重要的腐敗菌之一，能夠加速魚體病變部位的腐爛變質[20]。2-X-26與PlesiomonasshigelloidesAW28(GU324301.1)具有99 %的同源性，Plesiomonasshigelloides可引起魚類體色發黑、體表出血、鱗片脫落、鰭條潰爛等癥狀，是多種魚類重要的病原菌[21-22]。3-X-8與Flavobacteriumsp. T56L(JX287816.1)具有99 %的同源性，Flavobacterium屬細菌廣泛存在于水體、土壤和動植物等環境中，Leydis Z等[23]從患病的虹鱒魚中分離得到Flavobacteriumplurextorumsp. nov.新種，是潛在的魚類病原菌。

表2 冷水魚可培養細菌鑒定

續表2 Continued table 2

菌株編號Sample name近源序列Similarity sequence相似度(%)Similarity分類地位(屬)Genus登陸號Landing number1-X-24Micrococcus sp. AX5(KP126827.1 )100MicrococcusMH3079811-X-32Chryseobacterium sp. ARS145-11(JX827616.1 )99ChryseobacteriumMH3079821-X-33Janthinobacterium sp.M1-12(MG757982.1)99JanthinobacteriumMH3079831-X-35、2-X-37Microbacterium sp.KBL11(MG576164.1 )100MicrobacteriumMH3079842-X-8、3-X-9Pseudomonas sp. DNE-S2(MF803833.1 )100PseudomonasMH3079852-X-26Plesiomonas shigelloides AW28(GU324301.1)99PlesiomonasMH3079862-X-56Macrococcus caseolyticus GCFS2(MG722794.1 )99MicrococcusMH3079873-X-2Deinococcus sp. MZDSW(KY435503.1 )100DeinococcusMH3079883-X-7Moraxella sp.GM2(JF837191.1)99MoraxellaMH3080013-X-8Flavobacterium sp. T56L(JX287816.1)99FlavobacteriumMH3079893-X-14Exiguobacterium aurantiacum TAGEM15-70-B31(MG685824.1 )99ExiguobacteriumMH3079903-X-17Serratia liquefaciens Mt16(MF624481.1 )99SerratiaMH3079913-X-22Brevundimonas intermedia NW33(JF915341.1 )99BrevundimonasMH3079923-X-23Arthrobacter sp. MDT2-15(JX949674.1 )99ArthrobacterMH3079933-X-24Sphingomonas sp. NA53(LN832013.1 )100SphingomonasMH3079993-X-25Sphingomonas sp. CCGE4035(GU980224.1 )99SphingomonasMH3079943-X-28Kocuria polaris PGd6(MG029449.1)100KocuriaMH3080003-X-32、3-X-27Arthrobacter sp.FRA03P48(MG860335.1 )99ArthrobacterMH3079953-X-34Massilia aurea HME9229(KF911334.1 )99MassiliaMH3079963-X-36Deefgea rivul S-T-TSA-63(JX860598.1)100DeefgeaMH3079973-X-42、3-X-13Lactococcus piscium TJ-1-25(MF157588.1 )100LactococcusMH307998

圖2 冷水魚皮膚病灶中可培養細菌系統進化樹

表3 冷水魚可培養真菌鑒定

2.3 冷水魚真菌ITS序列的鑒定

由表3可知，對共計54株真菌進行了分子生物學鑒定，結果發現：分離自西藏3種冷水魚病灶部位的真菌主要分布在接合菌綱(Zygomycetes)、座囊菌綱(Dothideomycetes)、散囊菌綱(Eurotiomycetes)、卵菌綱(Oomycetes)、銀耳綱(Tremellomycetes)、酵母綱(Saccharomycetes)和絲孢綱(Hyphomycetes)。3種冷水魚病灶部位真菌主要有毛霉屬(Mucor)、枝孢菌屬(Cladosporium)、根霉屬(Rhizopus)、莖點霉屬(Phoma)、派倫霉屬(Peyronellaea)、青霉屬(Penicillium)、水霉屬(Saprolegnia)、鏈格孢屬(Alternaria)、小球殼孢屬(Microsphaeropsis)、鐮刀菌屬(Fusarium)、小球腔菌屬(Leptosphaeria)、網孢菌屬(Filobasidium)、假絲酵母屬(Candida)、支頂孢屬(Acremonium)和隱球菌屬(Cryptococcus)等15屬。序列BLAST比對及系統進化分析結果表明(圖3)： 1-Z-1、2-Z-39與MucorracemosuslhWWF65具有100 %的同源性，毛霉屬(Mucor)真菌通常在機體營養不良、抵抗力低下和體表損傷時侵入機體組織，是一類致命的條件致病菌，楊鳶劼等[24]對暗紋東方鲀病理組織切片觀察發現毛霉屬真菌可在魚體形成環狀蒼白圈，體表病灶中心常出現糜爛潰瘍，最后延伸至肌肉導致魚體死亡。2-Z-4與SaprolegniaparasiticaCNUaq1具有99 %的同源性，水霉屬(Saprolegnia)真菌可引起水生動物感染水霉病，水霉病是現代水產養殖業的重要危害病原菌之一，水霉感染后會造成魚體死亡、魚卵孵化率降低等危害，我國致病性水霉菌主要為寄生水霉(Saprolegniaparasitica)和多子水霉(Saprolegniaferax)，其中寄生水霉孢子萌發快，侵襲能力強，對我國淡水魚類危害尤其嚴重，每年對淡水水產養殖業造成巨大經濟損失[25-26]。

圖3 冷水魚皮膚病灶中可培養真菌系統進化樹

3 討論與結論

目前，有關雅魯藏布江流域冷水魚微生物的研究鮮有報道，本文首次對雅魯藏布江流域黑斑原鮡、異齒裂腹魚和拉薩裸裂尻等3種冷水魚皮膚病灶中可培養微生物進行了分析，研究結果表明：西藏3種冷水魚皮膚病灶部位可培養細菌主要分布在α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、β-變形菌綱(Betaproteobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、黃桿菌綱(Flavobacteria)、放線菌綱(Actinobacteria)、異常球菌綱(Deinococci)、芽孢桿菌綱(Bacilli)及厚壁菌門(Firmicutes)等1門、7綱21屬25種，可培養真菌主要分布在接合菌綱(Zygomycetes)、座囊菌綱(Dothideomycetes)、散囊菌綱(Eurotiomycetes)、卵菌綱(Oomycetes)、銀耳綱(Tremellomycetes)、酵母綱(Saccharomycetes)和絲孢綱(Hyphomycetes)等7綱15屬24種，從3種冷水魚皮膚病灶部位共計分離得到36屬49種微生物，黑斑原鮡、異齒裂腹魚和拉薩裸裂尻等3種冷水魚皮膚病灶部位中可培養微生物種類較多。

微生物性病原菌引起的魚類疾病具有發病急、傳播快、發病率高和死亡率高等特點，是危害較大的魚類常見疾病，近年來備受國內外魚病研究工作者的關注[27-28]。本文從西藏冷水魚皮膚病灶部位分離的Aeromonashydrophila、Paenisporosarcinasp.、Chryseobacteriumsp.、Pseudomonassp.、Plesiomonasshigelloides、Flavobacteriumsp.、Mucorsp.和Saprolegniaparasitica等已被報道是多種魚類的病原菌，因此，筆者認為能夠對西藏冷水魚的健康養殖形成威脅的這8種病原微生物值得重點關注。另外，沙雷氏菌屬(Serratia)、乳球菌屬(Lactococcus)、假絲酵母屬(Candida)等菌株能夠產生蛋白酶、脂肪酶等活性物質，它們是加速肉類食品腐敗變質的重要微生物，在魚體表出現斑狀病變后能夠迅速感染魚肌肉組織，導致魚類體表常出現大面積糜爛潰瘍，加速魚類病理死亡[29-30]。同時，本文從冷水魚病灶部位還分離得到微球菌屬(Micrococcus)、微桿菌屬(Microbacterium)、微小桿菌屬(Exiguobacterium)、節細菌屬(Arthrobacter)等放線菌和根霉屬(Rhizopus)、青霉屬(Penicillium)、小球殼孢屬(Microsphaeropsis)、小球腔菌屬(Leptosphaeria)、支頂孢屬(Acremonium)等真菌，它們能夠產生大量的化學結構新穎、抑菌效果較好或有特殊作用的生物活性物質，可能對上述病原微生物的防治具有貢獻[31-33]。

本文對西藏3種冷水魚皮膚病灶中可培養微生物及其病原微生物進行了探討分析，初步明確了黑斑原鮡、異齒裂腹魚和拉薩裸裂尻等3種冷水魚皮膚病灶中可培養微生物種類及其潛在病原微生物種屬，下一步將繼續開展以下幾方面的研究工作：①開展8種冷水魚疑似病原微生物的人工感染及其藥物敏感試驗，明確疑似病原微生物的致病特性及其防治措施；②研究Micrococcussp.、Microbacteriumsp.、Exiguobacteriumsp.、Arthrobactersp.、Rhizopussp.、Penicilliumsp.、Microsphaeropsissp.、Leptosphaeriasp.、Acremoniumsp.等病灶分離菌株對8種疑似病原微生物的拮抗作用，提取上述分離微生物的次級代謝化合物并開展其抑菌活性分析；③探討沙雷氏菌屬(Serratia)、乳球菌屬(Lactococcus)、假絲酵母屬(Candida)等分離菌株的蛋白酶、脂肪酶活性，明確其在冷水魚病變死亡后期的促進魚肉腐敗、變質及潰爛等協同效果。