基于堅果表型性狀的新疆核桃種質資源多樣性與分類

李亞蘭，潘存德，范江濤，陳 虹，王世偉，阿卜杜如蘇力·庫爾班江，張田友

(新疆農業大學林學與園藝學院/新疆教育廳干旱區林業生態與產業技術重點試驗室，新疆 烏魯木齊 830052)

【研究意義】核桃(JuglansregiaL.)系胡桃科(Juglandaceae)胡桃屬(Juglans)多年生落葉喬木，是世界重要的堅果樹種之一[1-2]。其堅果不僅風味獨特，而且具有極高的營養、保健和藥用價值[3-4]。新疆作為我國核桃的重要產區之一，不僅有野生核桃的種質資源分布，而且有千年以上悠久的栽培歷史[5]，在自然和人為的雙重作用下孕育了豐富的核桃種質資源。種質資源的遺傳多樣性評價是種質資源保護和挖掘利用的基礎，相對于采用分子標記評價種質資源的遺傳多樣性，應用表型性狀評價種質資源的遺傳多樣性更加簡便直觀，具有不可替代性，被廣泛應用于不同植物種質的分類鑒定和核心種質的構建[6-7]?！厩叭搜芯窟M展】表型性狀多樣性在植物種質資源研究中應用廣泛，如通過對枇杷(Eriobotryajaponica)[8]、香蕉(Musanana)[9]和櫻桃(Prunuspseudocerasus)[10]等多種園藝作物表型性狀進行統計分析，在一定程度上揭示了其種質遺傳變異規律，并為育種工作提供了性狀選擇的依據。另外，在對榛子(Corylusheterophylla)[11]、扁桃(Amygdaluscommunis)[12]、腰果(Anacardiumoccidentale)[13]和板栗(Castaneamollissima)[14]等堅果類果樹的表型多樣性研究中，均以堅果的表型多樣性作為研究其多樣性的重要內容，并為種質資源的初步分類鑒定和對主要經濟性狀的深入了解提供了依據。【本研究切入點】核桃作為重要的堅果類果樹，通過表型性狀測定分析對其遺傳多樣性進行評價的研究相對較少，且主要以堅果的表型性狀指標為主[15-17]。通過表型性狀測定分析對新疆核桃種質遺傳多樣性進行評價的研究更是少之又少，且選用的表型性狀指標非常有限[18]。【擬解決的關鍵問題】在對新疆人工栽培的鄉土核桃種質資源進行全面綜合考察的基礎上，本研究通過對165份新疆人工栽培的鄉土核桃種質資源堅果表型性狀的調查與測定，基于堅果表型性狀測定的5個數量性狀指標和13個質量性狀多態性指標，旨在揭示其堅果表型性狀所表征的種質遺傳多樣性水平和類群，以期為采用形態學分析與分子標記技術相結合的方法挖掘優質核桃種質資源提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

經過對新疆人工栽培的鄉土核桃種質資源的全面綜合考察，以新疆核桃產區南疆盆地和田、喀什、阿克蘇地區廣泛收集的165份人工栽培的鄉土核桃種質作為供試材料，其中包括栽培品種種質66份；實生優良單株種質47份；古樹種質52份(樹齡≥100年)。

1.2 方法

1.2.1 堅果表型數量性狀指標測定與分析方法 針對每一份供試種質，在果實成熟期其盛果期植株上隨機摘取成熟的果實10個，剝去外果皮得到的堅果晾干至恒重后測定其表型數量性狀指標。堅果表型數量性狀指標包括3個可直接測量指標，即：堅果縱徑(NL)、橫徑(NW)、側徑(NH)和2個衍生指標，即：果形指數(INS)和三徑均值(TDM)。利用游標卡尺(0.01 mm)分別對每一份種質10個堅果的3個可直接測量指標進行指標值測定，并求算各指標測定值的算術平均值作為種質對應指標的指標值，再由3個可直接測量指標的指標值計算得到2個衍生指標的指標值，即：INS=NL×2/(NW+NH)；TDM=(NL+NW+NH)/3。采用K-S檢驗方法對表型數量性狀指標進行正態分布檢驗，符合正態分布的表型數量性狀指標按照(X-1.2818S)、(X-0.5246S)和(X+0.5246S)、(X+1.2818S)4個分級點分為5級，其中：X表示堅果表型數量性狀指標平均值；S表示堅果表型數量性狀指標標準差。不符合正態分布的指標則按實際分布狀況分級[19]。最后，根據每一份供試種質其堅果表型數量性狀指標的指標值和對應的堅果表型數量性狀指標的4個分級點統計分別歸入五個級的種質份數，并計算出每一級的種質份數占總供試種質份數的比率(頻率)。堅果表型數量性狀的多樣性分析采用頻率分布法。

1.2.2 堅果表型質量性狀指標測定與分析方法 針對完成表型數量性狀指標測定后的每一份種質的堅果，參考《植物新品種特異性、一致性、穩定性測試指南—核桃屬》[20]進行堅果表型質量性狀指標測定。堅果表型質量性狀指標包括13個多態性指標，即：堅果沿縫合線縱切面形狀(SLSTS)、垂直于縫合線縱切面形狀(SLSPS)、橫切面形狀(SCS)、果基形狀(SBPS)、果肩形狀(SAPS)、頂尖突出程度(PAT)、核殼光滑度(SS)、脊分布(DR)、脊寬度(WR)、脊突出程度(DPR)、脊旁凹槽深度(DGR)、核殼表面刻紋(SSE)和核殼表面刻窩(SSF)。堅果表型質量性狀多態性指標測定采用編碼數值轉化法(表1)。最后，根據每一份供試種質其堅果表型質量性狀多態性指標的編碼值統計各態的種質份數，并計算出各態的種質份數占總供試種質份數的比率(頻率)。堅果表型質量性狀的多樣性分析采用 Simpson 指數(D)[21]和Shannon-Weaver 指數(H′)[22]。計算公式如下：

其中：S是指堅果某一表型質量性狀指標多態性的數量；Pi是指堅果某一表型質量性狀指標第i種多態性種質份數占總供試種質份數的比例。

1.2.3 聚類分析方法 采用系統聚類組間聯接的方法對165份供試的新疆人工栽培的鄉土核桃種質進行聚類，并采用歐氏距離得到的近似矩陣繪制聚類樹狀圖。

表1 核桃堅果表型質量性狀觀測項目及編碼規則

利用Microsoft Excel 2016進行原始數據的整理和計算；利用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析；利用MEGA 7.0.26軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 種質堅果表型數量性狀的頻率分布

2.1.1 堅果縱徑 供試核桃種質堅果縱徑最小值18.05 mm(KSWZ-10)，最大值56.71 mm(KSLW-14)，變異系數0.13(表2。下同)。其正態概率五級分級的縱徑大小、種質數量頻率和代表種質為：Ⅰ級，≤33.11 mm，5.4 %，代表種質為KSWZ-2；Ⅱ級，33.12～37.00 mm，23.0 %，代表種質為KSSW-1；Ⅲ級，37.01～42.39 mm，47.3 %，代表種質為KSSW-2；Ⅳ級，42.40～46.27 mm，15.8 %，代表種質為CW-6；Ⅴ級，≥46.28 mm，8.5 %，代表種質為KSOW-9。

2.1.2 堅果橫徑 供試核桃種質堅果橫徑最小值19.10 mm(KSWZ-10)，最大值43.91 mm(KSOW-25)，變異系數0.10。堅果橫徑概率五級分級的橫徑大小、種質數量頻率和代表種質為：Ⅰ級，≤30.35 mm，8.5 %，代表種質為KSOW-3；Ⅱ級，30.36～32.96 mm，17.6 %，代表種質為KSLW-7；Ⅲ級，32.97～36.85 mm，44.2 %，代表種質為KSOW-4；Ⅳ級，36.86～39.19 mm，23 %，代表種質為KSOW-9；Ⅴ級，≥39.20 mm，6.7 %，代表種質為KSOW-12。

2.1.3 堅果側徑 供試核桃種質的堅果側徑中，最小值為20.25 mm(KSWZ-10)，最大值為46.46 mm(AKSCW-20)，變異系數0.12。堅果側徑概率五級分級的大小、種質數量頻率和代表種質為：Ⅰ級，≤30.69 mm，7.3 %，代表種質為KSOW-10；Ⅱ級，30.70～33.92 mm，23.0 %，代表種質為KSOW-3；Ⅲ級，33.93～38.40 mm，41.8 %，代表種質為KSOW-15；Ⅳ級，38.41～41.64 mm，16.4 %，代表種質為KSLW-3；Ⅴ級，≥41.65 mm，11.5 %，代表種質為KSOW-12。

2.1.4 三徑均值 供試核桃種質的堅果三徑均值中，最小值為19.14 mm(KSWZ-10)，最大值為46.59 mm(AKSCW-12)，變異系數0.10。堅果三徑均值大小、種質數量頻率和代表種質為：1級，≤31.93 mm，6.7 %，代表種質為KSOW-9；2級，31.93～34.85 mm，20.6 %，代表種質為AKSCW-9；3級，34.85～38.90 mm，44.8 %，代表種質為AKSCW-41；4級，38.90～41.82 mm，18.24 %，代表種質為AKSCW-21；5級，≥41.82 mm，9.7 %，代表種質為AKSCW-20。

2.1.5 果形指數 供試核桃種質的堅果果形指數中，最小值為0.86 mm(AKSCW-14)，最大值為1.46 mm(KSSW-14)，變異系數0.10。堅果果形指數大小、種質數量頻率和代表種質為：I級，≤0.98 mm，9.7 %，代表種質為KSSW-1；II級，0.99～1.06 mm，24.8 %，代表種質為CW-1；III級，1.07～1.18 mm，35.8 %，代表種質為KSWZ-3；IV級，1.19～1.26 mm，20.0 %，代表種質為KSOW-46；V級，≥1.27 mm，9.7 %，代表種質為KSLW-14。

表2 核桃種質堅果表型數量性狀指標頻率分布

2.2 種質堅果表型質量性狀的頻率分布和多樣性

2.2.1 堅果形狀特征 堅果形狀特征可以分解為5個多態性形狀指標進行描述(表3)，即：沿縫合線縱切面形狀(SLSTS)、垂直于縫合線縱切面形狀(SLSPS)、堅果橫截面形狀(SCS)、果基形狀(SBPS)和果肩形狀(SAPS)。

SLSTS可歸納為橢圓形、闊橢圓形、長圓形、圓形、卵圓形、闊卵圓形和三角形7種類型(圖1)，在供試核桃種質中其頻率分布為21.80 %、17.60 %、23.60 %、17.60 %、15.20 %、3.60 %和0.60 %，其D和H′分別為0.723和2.960。SLSPS也可分為圓形、扁圓形、卵圓形、闊橢圓形、長橢圓形、梯形和長圓形7種類型，在供試核桃種質中其頻率分布為53.90 %、13.30 %、12.70 %、2.40 %、7.30 %、3.60 %和6.80 %，其D和H′分別為0.24和2.990。SCS僅有圓形和扁圓形2種，在供試核桃種質中其頻率分布為13.9 %和86.1 %，其D和H′分別為0.240和1.580。SBPS可分為凹、圓、平和尖4種類型，在供試核桃種質中其頻率分布為15.7 %、20 %、46.7 %和17.6 %，其D和H′分別為0.687和2.838。SAPS也可分為凹、圓、平和尖4種類型(圖2)，在供試核桃種質中其頻率分布為7.9 %、37 %、41.8 %和13.3 %，其D和H′分別為0.664和2.733。

2.2.2 核殼表面特征 堅果核殼表面特征則可以分解為8個多態性指標進行描述(表3)，即：果殼光滑度(SS)、核殼表面刻窩(SSF)、核殼表面刻紋(SSE)、頂尖突出程度(PAT)、脊分布(DR)、脊寬度(WR)、脊突出程度(DPR)和脊旁凹槽深度(DGR)進行描述。

SS僅有2種類型，在供試核桃種質中其頻率分布為18.80 %和81.20 %，其D和H′分別為0.305和1.697。SSF和SSE均可分為3個等級，即：少、中、多，在供試核桃種質中前者3個等級的頻率分布為48 %、32 %和20 %，其D和H′分別為0.625和0.517；后者3個等級的頻率分布為3 %、41 %和56 %，其D和H′分別為2.505和2.147。

表3 核桃種質堅果表型質量性狀多態性指標多樣性指數

圖1 核桃種質堅果沿縫合線縱切面形狀和垂直于縫合線縱切面形狀

圖2 核桃種質堅果頂尖突出程度和果基形狀

PAT按照堅果頂尖突出程度分為凹、平、凸和尖4種類型(圖2)，在供試核桃種質中其頻率分布為2 %、30 %、41 %和27 %，其D和H′分別為0.687和2.671。DR可分為上1/2、上2/3和貫通3種類型，在供試核桃種質中其頻率分布為2.4 %、66.7 %和30.9 %，其D和H′分別為0.459和2.044。WR有細、窄、中和寬4種類型，在供試核桃種質中WR為細的比較極少，僅占0.6 %，其余3種類型在供試核桃種質中其頻率分布為21.8 %、52.1 %和25.5 %，其D和H′分別為0.616和2.516。DPR有2種類型，即平和凸，在供試核桃種質中其頻率分布為55.2 %和44.8 %，其D和H′分別為0.495和1.992。DGR按照凹陷深度可分為淺、中和深3種類型，在供試核桃種質中其頻率分布為27.9 %、41.2 %和30.9 %，其D和H′分別為0.657和2.564。

2.3 核桃種質資源聚類

依據堅果的18個表型性狀指標對供試的165份核桃種質進行聚類分析，結果顯示，在遺傳距離為4處可將其分為9類。第一類群(Cluster 1，圖3，下同)包括49份種質，主要以栽培品種種質和古樹種質為主，其堅果性狀主要特征為垂直于縫合線縱切面形狀為圓形，頂尖突出程度凸和尖，果肩圓，果基圓、凹，脊分布上2/3，脊寬度中，脊旁凹槽深度中、深。

第二類群(Cluster 2)包括15份種質，主要以栽培品種種質為主，其堅果性狀主要特征為垂直于縫合線縱切面形狀為圓形，頂尖突出程度凸和平，果肩圓、平，果基圓，脊分布貫通、上2/3，脊寬度中、窄，脊突起程度平，脊旁凹槽深度中。

第三類群(Cluster 3)包括51份種質，主要以古樹種質和實生優良單株種質為主，其堅果性狀主要特征為沿縫合線縱切面形狀為長圓形、橢圓形，頂尖突出程度凸和尖，果肩平，果基圓，脊分布上2/3，脊突起程度凸，脊旁凹槽深度中、深。

第四類群(Cluster 4)包括13份種質，主要以實生優良單株種質和栽培品種種質為主，其堅果性狀主要特征為沿縫合線縱切面形狀為橢圓形，頂尖突出程度凸和尖，果肩圓、平，果基圓、平，脊分布上2/3，脊寬度中、寬，脊突起程度凸、平，脊旁凹槽深度淺和中。

第五類群(Cluster 5)包括11份種質，主要以栽培品種種質為主，其堅果性狀主要特征為沿縫合線縱切面形狀為圓形、卵圓形，頂尖突出程度凸，果肩圓，果基圓，脊分布上2/3，脊寬度中、寬，脊突起程度凸、平，脊旁凹槽深度深。

圖3 供試核桃種質聚類圖

第六類群(Cluster 6)包括11份種質，主要以栽培品種種質為主，其堅果性狀主要特征為沿縫合線縱切面形狀為橢圓形，頂尖突出程度凸，果肩平，果基圓，脊分布上2/3，脊寬度中，脊突起程度平，脊旁凹槽深度中。

第七類群(Cluster 7)包括6份種質，主要以實生優良單株種質為主，其堅果性狀主要特征為沿縫合線縱切面形狀為長圓形，頂尖突出程度平，果肩平，果基圓，脊分布貫通，脊寬度中和窄，脊突起程度平，脊旁凹槽深度淺。

第八類群(Cluster 8)包括7份種質，主要以古樹種質為主，其堅果性狀主要特征為沿縫合線縱切面形狀為橢圓形，頂尖突出程度凸、尖，果肩圓，果基尖，脊分布貫通，脊寬度中，脊突起程度凸，脊旁凹槽深度深。

第九類群(Cluster 9)包括2份種質，即：種質AKSCW-5和種質AKSCW-38，其堅果性狀主要特征為其頂尖突出程度為平，脊分布上2/3，脊寬度中，脊突起程度平，脊旁凹槽深度淺。

3 討 論

植物表型性狀為植物遺傳多樣性的最直接反映，是衡量其遺傳多樣性的重要途徑和關鍵指標[23]，對揭示植物的基因型具有重要意義[24]，并對農林生產中品種選擇與育種工作有重要影響。國內外在對核桃種質表型性狀所表征的遺傳多樣性研究中，普遍采用表型數量性狀指標，如巴基斯坦[25]、土耳其[26]、阿爾巴尼亞[27]等地鄉土核桃品種的表型多樣性分析。在表型數量性狀的分析研究中較常使用的方法是概率分級，不僅有助于使調查結果更直觀，而且有利于采用統計方法進行分析[28-29]，如杏(Armeniacavulgaris)[20]、葡萄(Vitisvinifera)[30]、草莓(Fragaria×ananassa)[31]等園藝作物種質表型數量性狀所表征的遺傳多樣性研究中均已使用此方法并得到了良好效果。有學者在對四川省核桃種質的研究中采用概率分級方法將堅果表型數量性狀指標分為五級[32]，本研究中也采用了與其相同的分級方法和分級數量對堅果表型數量性狀指標進行了分級，不僅反映出了165份供試核桃種質其堅果表型數量性狀指標值在各等級的頻率分布和由頻率分布所表征的堅果表型數量性狀多樣性的狀況，也為規范化、數量化描述新疆核桃種質堅果表型數量性狀指標提供了參考。此外，有研究顯示，西藏核桃種質其三徑均值介于26.75～39.95 mm[33]，四川涼山州核桃種質其三徑均值介于21.24～47.41 mm[34]，伊朗核桃種質其三徑均值介于23.5～41.6 mm[35]，羅馬尼亞西南部核桃種質其三徑均值介于26.9～43.6 mm[36]，以上這些區域的核桃種質其三徑均值介于21.24～47.41 mm，而本研究中核桃種質的三徑均值則在19.14～46.59 mm，其中包含了部分獨特的小果型種質，表明本研究供試核桃種質堅果多樣性十分豐富，保存其中的小果型種質對保護核桃種質資源的多樣性具有重要意義。

植物表型性狀中的多態性質量性狀同樣是研究其遺傳多樣性的重要途徑和指標，且具有數量性狀所不具備的對環境影響不敏感的特點，能夠比較客觀地反映個體或群體的遺傳多樣性[37]，有利于明確的分類和鑒定[38]。對植物表型質量性狀多態性指標值的頻率分布進行分析，同樣能夠反映其質量性狀多樣性的狀況，本研究165份供試核桃種質其堅果表型質量性狀多態性指標值的頻率分布顯示：13個質量性狀指標共包括48種多態性類型，各表性質量性狀指標的不同多態性類型中均有核桃種質分布，表明供試核桃種質其質量性狀多態性類型較為豐富。與此同時，也反映出各表型質量性狀多態性指標的頻率分布存在一定程度的差異，譬如，相對于其它表型質量性狀指標，頂尖突出程度(PAT)、脊分布(DR)和脊寬度(WR)的多態性指標頻率分布變化幅度較大。這可能與自然變異和環境選擇等因素的影響有關[24]。此外，D和H′ 已在植物表型質量性狀多樣性的評價中得到廣泛應用[39,10-11]，其數值大小反映了表型質量性狀多態性的豐富度和均勻度[40]。本研究結果顯示，165份供試核桃種質堅果其13個表型質量性狀多態性指標的D和H′變化范圍分別為0.240～0.723和1.583～2.990，表明供試核桃種質堅果質量性狀表型多樣性較為豐富。但不同堅果表型質量性狀之間存在一定差異，如核殼光滑度、橫切面形狀的D和H′較小，表明表型多樣性程度較低；而沿縫合線縱切面形狀、垂直于縫合線縱切面形狀、果基形狀、果肩形狀等的D和H′較大，表明存在廣泛的遺傳變異。

有研究表明，聚類分析在植物表型性狀的研究中均獲得良好效果，其不僅能夠為種質分類提供科學合理的方法，而且研究結果還能夠為選擇育種提供重要依據[41-42]。聚類分析方法的實質就是綜合考察大量性狀指標，利用多元統計分析將供試對象分到相對同質的群組中的一種數學方法[43]。本研究其于堅果的18個表型性狀指標采用系統聚類方法對165份供試核桃種質進行聚類，結果顯示被劃分為9個類群。從分類結果來看，各類群的劃分主要是基于堅果大小、形狀、核殼特征等性狀的相似性，如第九類群(Cluster 9)中“AKSCW-5”和“AKSCW-38”兩份種質具有較為一致的獨特堅果表型性狀特征，同時兩份種質被單獨聚為一類，一定程度上反映二者的遺傳背景相對較為復雜。從分類結果的地理分布來看，供試種質并沒有明顯的地域型類型，如第三類群(Cluster 3)中“AKSCW-3”、“AKSHQ-2”和“KSOW-30”等供試種質是分別來自阿克蘇地區和喀什地區的核桃種質，雖然分布地點不同，但其堅果表型性狀相似度較高。在板栗(Castaneamollissima)[44]、麻櫟(Quercusacutissima)[45]等木本植物種質的聚類分析中也有類似的現象。對于核桃而言，這可能與核桃堅果作為普通商品，在市場上的交易或作為禮物人為地進行交流[46-47]，或天然雜交和實生選擇育種方式[48]有關。同時，聚類分析結果還顯示來自喀什地區的核桃古樹種質在多個類群體中均有存在，這在一定程度上體現了古樹種質在新疆核桃種質資源歷史形成過程中的重要地位。

此外，本研究對165份新疆人工栽培的鄉土核桃種質的堅果表型性狀進行了詳細統計、分析和評價，并以一種簡便易行、易于識別的方法進行研究，所得數據具有一定的代表性，在一定程度上反映了新疆核桃種質資源的多樣性，為今后深入研究新疆核桃種質資源的遺傳多樣性奠定了基礎。但表型性狀的表現型是基因型與環境因子共同作用的結果，且表現型受環境因素影響較大。因此，還應該補充其花序、枝條、葉片、樹體等特征后構建完整的核桃表型數據庫，同時進行分子水平的相關性研究，才能更加全面、準確地對核桃種質資源進行客觀評價。

綜上所述，供試核桃種質堅果表型數量性狀多樣性較為豐富，符合K-S正態分布，其中堅果縱徑37.00～42.39 mm、橫徑32.96～36.85 mm、側徑33.92～38.40 mm和三徑均值34.85～38.90 mm所占比例最高；堅果表型質量性狀中沿縫合線縱切面形狀、垂直于縫合線縱切面形狀、果基形狀、果肩形狀等的多樣性水平較高。采用系統聚類方法得到，供試核桃種質被劃分為9個類群，分類結果與堅果大小、形狀、核殼特征等表型性狀相關，不完全與其地理分布相關?；趫怨硇托誀畹姆N質資源多樣性分析為新疆核桃種質資源的多樣性評價提供了一定基礎，同時也顯示出新疆鄉土核桃種質資源堅果表型多樣性水平高，蘊藏著豐富的遺傳資源，具有較大的挖掘利用潛力。