利用CRISPR/Cas9系統構建人HPRT1基因定點突變細胞株

張楷，劉蔚，劉小鳳，陳瑤生，劉小紅，何祖勇

研究報告

利用CRISPR/Cas9系統構建人基因定點突變細胞株

張楷，劉蔚，劉小鳳，陳瑤生，劉小紅，何祖勇

中山大學生命科學學院，有害生物控制與資源利用國家重點實驗室，廣州 510006

Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase1 ()基因突變會導致次黃嘌呤和鳥嘌呤代謝異常，嚴重的代謝障礙被稱為Lesch-Nyhan綜合征，表現為智力低下，行為上出現強迫性自我毀傷，并伴隨痛風或腎結石等癥狀。基因具有多種突變模式，近年來對其突變譜的研究表明該基因具有一些“突變熱點”。本研究選取了導致翻譯提前終止的熱點突變c.508C>T突變和c.151C>T突變，在HEK293T和HeLa細胞中，以單鏈寡核苷酸(single-stranded oligo-deoxyribonucleotides, ssODN)作為同源重組模板，利用CRISPR/Cas9技術構建了這兩種突變的單克隆細胞株，發生定點突變的效率分別為16.3%和10%。進一步通過Western blot檢測點突變的單克隆細胞的HPRT1蛋白表達水平，通過6-TG毒性實驗檢測點突變的單克隆細胞的次黃嘌呤/鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶活性，結果表明純合突變的單細胞克隆不能正常表達HPRT1蛋白，其次黃嘌呤/鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶活性喪失；雜合突變的單細胞克隆的HPRT1蛋白表達量降低，仍具有部分次黃嘌呤/鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶活性。基因定點突變細胞模型的建立可為今后建立其他基因突變的細胞系或動物模型提供借鑒，為研究Lesch-Nyhan致病機制提供基礎。

CRISPR/Cas9；；基因定點突變

CRISPR/Cas9基因編輯系統自問世以來獲得了舉世矚目的關注與飛速的發展，被廣泛地應用到多個物種，同時因其高效、精準的特點被越來越多地運用到分子治療領域。利用……