高效液相色譜法檢測嬰幼兒配方乳粉中酪蛋白磷酸肽

魏 敏，李興佳，柴艷兵，李 飛，劉 麗，張耀廣*

（石家莊君樂寶乳業有限公司，農業農村部乳品質量安全控制重點實驗室，河北 石家莊 050021）

酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptide，CPP）是酪蛋白經適合的蛋白酶消化所得的一系列含有磷酸絲氨酸簇的短肽[1]。大量研究表明，CPP可以提高繁殖能力、降低腫瘤發生率、增強免疫力等[2-5]。因此，越來越多的保健食品、嬰幼兒配方乳粉配方將CPP作為營養強化劑進行添加[6-8]。

我國對于嬰幼兒配方乳粉中CPP含量的測定尚無公開、統一的方法和標準[9-12]。目前，研究較多的檢測方法有毛細管區帶電泳法、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[13-14]和液相色譜-質譜聯用法[15-17]。由于毛細管區帶電泳法操作復雜，液相色譜-質譜聯用法價格昂貴，HPLC已逐漸成為檢測CPP的主要方法[18-20]。目前，HPLC檢測方法前處理復雜，本研究通過優化樣品前處理方法和上機檢測條件，旨在建立一種前處理簡單、快速、回收率穩定的嬰幼兒配方乳粉中CPP含量的HPLC檢測方法，為相關標準的制定提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CPP原料（純度89.5%）丹麥Arla公司；嬰幼兒配方乳粉7個不同品牌市售。

乙腈（色譜純）德國默克公司；三氟乙酸（色譜純）、鹽酸（分析純）天津市大茂化學試劑廠；實驗用水為符合GB/T 6682—2008《分析實驗室用水規格和試驗方法》規定的一級水。

1.2 儀器與設備

2695高效液相色譜儀美國Waters公司；BS224S電子天平瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

準確稱取CPP 0.050 0 g（CPP原料純度89.5%，折算后稱取CPP原料0.055 9 g），用水定容至50 mL，配制成CPP質量濃度為1.0 mg/mL的標準儲備液；分別準確吸取5、10、20、40、60、80、100 μL上述標準儲備液，用水定容至1 mL，配制成CPP質量濃度分別為5、10、20、40、60、80、100 μg/mL的標準工作液。

1.3.2 樣品溶液的制備

準確稱取5.00 g乳粉置于三角瓶中，用25 mL水攪拌溶解，用1 mol/L鹽酸調節pH值至4.6后用水轉移至50 mL容量瓶，定容，振蕩搖勻，用濾紙過濾，經0.45 μm濾膜過濾后作為待測液。

1.3.3 CPP特征峰的確定

將CPP原料、不含CPP的配方乳粉及強化CPP配方乳粉作為樣品，分別進行HPLC分析，通過比較確定CPP的特征峰。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5.0 μm）；流動相：A相為0.05%三氟乙酸，B相為0.05%乙腈（或A相為0.05%冰乙酸，B相為0.05%乙腈）；流速1 mL/min；柱溫55℃；檢測波長215 nm；進樣量20.0 μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table1 Gradient elution procedure

1.3.5 CPP含量計算

樣品中CPP含量按下式計算。

式中：X為樣品中CPP含量/（mg/100 g）；ρ為由標準曲線計算所得試樣中CPP的質量濃度/（μg/mL）；V為試樣定容體積/mL；m為樣品質量/g。計算結果保留3 位有效數字。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理方法的優化

表2 樣品前處理方法Table2 Sample pretreatments

表3 經不同前處理樣品的回收率及相對標準偏差Table3 Recovery and relative standard deviation for different pretreated samples

分別考察3 種樣品前處理方法（表2）的準確度和精密度。由表3可知，前處理方法1的加標回收率為69.93%～89.47%，RSD為5.77%～16.30%，前處理方法2的加標回收率為86.07%～91.77%，RSD為5.29%～13.90%，前處理方法3的加標回收率為94.50%～95.45%，RSD為4.54%～7.47%。結果表明，前處理方法3的準確度和精密度最高，且操作最簡單、方便。

2.2 流動相的優化

圖1 0.05%三氟乙酸-0.05%乙腈作為流動相的HPLC圖Fig.1 HPLC profile with 0.05% TFA-0.05% acetonitrile as mobile phase

圖2 0.05%冰乙酸-0.05%乙腈作為流動相的HPLC圖Fig.2 HPLC profile with 0.05% glacial acetic acid-0.05% acetonitrile as mobile phase

分別考察采用0.05%冰乙酸-0.05%乙腈和0.05%三氟乙酸-0.05%乙腈作為流動相體系時CPP的分離效果。由圖1～2可知，0.05%冰乙酸-0.05%乙腈作為流動相體系時，雜峰多且不易判定，0.05%三氟乙酸-0.05%乙腈作為流動相體系時峰形較好，分離度高，無拖尾現象。綜合分離效果、響應強度、保留時間及系統穩定性，最終選擇0.05%三氟乙酸-0.05%乙腈作為流動相體系。

2.3 CPP特征峰的確定

由圖3可知，CPP標準品和添加CPP的配方乳粉均在17.059 min出峰，而不添加CPP的配方乳粉在17.059 min處無色譜峰，因此可以確定該峰為定量檢測CPP的標志峰。

圖3 CPP加標樣品、空白樣品及標準溶液的HPLC圖Fig.3 HPLC profiles of spiked sample,blank sample and standard solution

2.4 方法的線性范圍、檢出限和定量限

按照確定好的樣品前處理條件和色譜條件對標準工作溶液進行測定，以CPP質量濃度為橫坐標，對應的峰面積為縱坐標，繪制CPP的標準曲線。結果表明，CPP質量濃度在5～100 μg/mL范圍內時線性關系良好，標準曲線方程為y=1.26×103x＋2.95×103（R2=0.999 8）。以信噪比（RS/N）=3結合空白基質噪音響應確定方法的檢出限為2 mg/100 g，以RS/N=10確定方法的定量限為5 mg/100 g。

2.5 實際樣品測定

表4 實際樣品測定結果Table4 Analytical results of actual samples

收集7 個品牌的市售嬰幼兒配方乳粉，對產品中的CPP含量進行檢測。由表4可知，本研究建立的方法能夠檢測出乳粉中是否含有CPP，并能夠準確測定乳粉中CPP的含量。因此，該方法可用于嬰幼兒配方乳粉中CPP的定量測定。

3 結 論

建立一種HPLC法檢測嬰幼兒配方乳粉中CPP含量的方法。以CPP標準品建立標準曲線，并對樣品前處理方法和色譜條件進行優化，選擇最優條件進行檢測。結果表明：最優前處理條件為用鹽酸（1 mol/L）調節樣品溶液pH 4.6后用水轉移至50 mL容量瓶中，用濾紙過濾后作為待測液；上機檢測時用0.05%三氟乙酸-0.05%乙腈作為流動相體系進行梯度洗脫；樣品加標回收率為94.50%～95.45%，線性良好（R2=0.999 8），方法檢出限為2.0 mg/100 g，定量限為5.0 mg/100 g。該方法樣品前處理簡單、穩定性、可靠性好，檢測結果滿足線性、精密度、準確度及檢出限要求，可用于嬰幼兒配方乳粉中CPP含量的測定，為相關檢測標準的出臺提供了理論依據和技術支撐。