西藏靈菇中Lactobacillus casei LC577的分離鑒定及特性

齊世華，張 棟，趙林森，艾連中，王世杰,4,*

（1.河北一然生物科技有限公司，河北 石家莊 050800；2.石家莊君樂寶乳業有限公司，河北 石家莊 050221；3.上海理工大學醫療器械與食品學院，上海 200093；4.河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018）

西藏靈菇，又稱藏靈菇、天山靈菇、雪蓮菌，是源于西藏林芝地區的菌類復合體，是多種菌共生形成的有機、統一整體，是一種傳統酸乳的天然發酵劑[1]。堅持飲用西藏靈菇發酵酸乳可以增強人體抵抗力[2-3]、調節免疫[4-5]、抗衰老[6-7]、抑制有害菌生長[8]等。

近年來，隨著生活水平的逐步提高，消費者對于食品的營養健康訴求逐漸加強。乳酸菌作為益生菌的主要來源，其功能性越來越受到消費者的認可，其主要作用包括調節腸道菌群平衡[9]、抗氧化[10]、降膽固醇[11]、降血壓[12]、調節免疫[13]及抗腫瘤[14]等。由于我國益生菌研究起步較晚，目前市場上的益生菌主要為國外引進的菌種，開發具有我國自主知識產權的益生菌迫在眉睫。西藏靈菇是以耐熱可魯維酵母、亞羅可魯維酵母為主體真菌，以乳酸桿菌、嗜酸乳桿菌、短乳桿菌和乳酸鏈球菌等乳酸菌為主體細菌構成的塊狀共生菌系[15]，其優良的保健功能可能與其微生物組成有關。本研究期望能夠從西藏靈菇中分離得到具有優良性狀的益生菌，為我國國產益生菌發展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

采集自西藏當雄縣當曲卡鎮牧民長年自制酸乳中自然形成的西藏靈菇。采用直接取樣法，樣品置于預先滅菌的50 mL離心管中，標記樣品號并做記錄，密封4℃保存。待所有樣品采集完成后帶回實驗室4℃保存備用。

1.1.2 培養基與試劑

10 g/100 mL脫脂乳、MRS培養基、細菌基因組提取試劑盒（DP302）天根生化科技（北京）有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

DPX-25BS-11生化培養箱、凈化工作臺上海新苗醫療器械制造有限公司；CX31RTSF顯微鏡日本奧林巴斯公司；D-37520高速離心機賽默飛世爾科技（中國）有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫療器械廠；7890A氣相色譜-5975C質譜聯用儀美國安捷倫公司；5078HW-1數顯恒溫磁力攪拌器杭州儀表電機有限公司；JJ200電子天平常熟市雙杰測試儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品中乳酸菌的分離純化及保存

取1 g樣品至無菌研缽，研碎后置于9 mL生理鹽水中振蕩混勻，梯度稀釋至體積比為1∶106后，分別取10-4、10-5、10-6稀釋液100 μL涂布于MRS固體培養基上，37℃厭氧培養48h；菌落形成后挑取形態特征不同的單菌落至MRS液體培養基中，37℃培養24h；通過顯微鏡觀察，將不純的菌株在MRS固體培養基上劃線分離、純化，37℃培養48h，反復操作至少3 次，直到鏡檢結果為純的單一菌株，編號、傳代[16]。

對分離、純化后的菌株進行過氧化氫實驗和革蘭氏染色實驗，將過氧化氫反應陰性的革蘭氏陽性菌株暫定為乳酸菌，取其MRS培養液1 mL與50%滅菌甘油以體積比1∶1混合后置于-80℃冰箱保存，同時另取1 mL MRS培養液進行RNA提取。

1.3.2 分離菌株的16S rRNA序列分析

采用細菌基因組小量提取試劑盒對分離純化后的菌株進行RNA提取。以提取的RNA為模板，以細菌通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）、1492R（5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’）為反應引物，進行16S rRNA基因的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增。PCR擴增結束后，取擴增產物2 μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增成功的樣品應在1 500 bp處有清晰的擴增條帶，且無明顯拖尾、彌散現象。將擴增成功的樣品送至北京中科希林生物科技有限責任公司進行純化、測序和拼接。

將測序得到的序列利用NCBI數據庫中的BLAST進行同源性分析，將鑒定菌株與模式菌株的16S rRNA序列一起運用MEGA 4.1以鄰接（Neighbor-Joining，N-J）法繪制系統發育樹，進行菌相分析[17]。

1.3.3 菌株產酸曲線的繪制

取所分離菌株的甘油保存管，將菌株接種至液體MRS培養基中連續活化3 代；按體積分數3%接種量接種于蛋白質含量為3 g/100 mL的巴氏滅菌脫脂復原乳中，培養溫度35℃。每隔3h記錄pH值，繪制菌株產酸曲線[18]。

1.3.4 發酵乳香氣分析

將活化后的菌株接種至12 g/100 mL的無菌脫脂乳中，37℃發酵72h，運用氣相色譜-質譜分析其發酵香氣。

頂空固相微萃取：取酸乳樣品7 mL，加入1 mL飽和NaCl溶液，60℃條件下用50/30 μm二乙烯苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取頭頂空恒溫萃取30 min，然后再將萃取頭在250℃進樣口熱解析5 min，進樣，進行氣相色譜-質譜解析。

色譜條件：D B-W A X聚乙二醇色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；He流速1.0 mL/min；升溫程序：起始溫度35℃，保持6 min，然后以8℃/min升至80℃，保持2 min，再以5℃/min升至110℃，最后以10℃/min升至210℃，保持10 min；進樣口溫度250℃（適用于DVB/CAR/PDMS萃取頭）。

質譜條件：電子轟擊離子源；電子轟擊能量70 eV；離子源溫度230℃。

1.3.5 菌株耐酸耐膽鹽實驗

挑取1 接種環分離菌株，接種到MRS培養基中，37℃培養48h，取出計數；同時各取1 mL該培養基，分別加入到pH值為2.5和含3 g/L牛膽鹽的MRS培養基中，37℃孵育，于孵育0、4h進行菌數測定，并計算存活率[19]。

2 結果與分析

2.1 樣品中乳酸菌的分離結果

從西藏靈菇中分離得到一株過氧化氫反應陰性[20-21]、革蘭氏染色陽性的疑似乳酸菌，將其命名為LC577。菌株LC577在MRS瓊脂培養基上形成的菌落為圓形、邊緣整齊、隆起、表面光滑、有光澤、白色、不透明，顯微鏡下為棒狀桿菌（圖1）。

圖1 菌株LC577的菌落（A）及顯微鏡（B）形態Fig.1 Colony(A)and microscopic(B)morphology of strain LC577

2.2 分離菌株LC577的16S rRNA序列分析

圖2 根據16S rRNA序列構建的菌株LC577進化樹Fig.2 Evolutionary tree for LC577 constructed based on 16S rRNA sequence

將測序得到的菌株LC577的RNA序列利用NCBI中的BLAST進行同源性分析，并與乳桿菌屬模式菌株以N-J法繪制系統發育樹。由圖2可知，菌株LC577與干酪乳桿菌模式菌株Lactobacillus caseiATCC 393T同源性最高，初步確定菌株LC577為干酪乳桿菌。

2.3 干酪乳桿菌LC577的產酸曲線

圖3 干酪乳桿菌LC577的產酸曲線Fig.3 Acid production curve of Lactobacillus casei LC577

由圖3可知，干酪乳桿菌LC577具有良好的產酸能力。在脫脂復原乳中發酵9h可凝乳，發酵14h時的pH值可迅速降至4.5，能避免發酵過程中的染菌風險，可滿足乳品廠家對于優良干酪乳桿菌發酵性能的要求；發酵至60h時，發酵乳pH值降至3.7～3.8，也可滿足乳品廠家對發酵中止時發酵乳酸度的要求。

2.4 干酪乳桿菌LC577發酵乳香氣分析

由圖4和表1可知，干酪乳桿菌LC577發酵乳香氣物質主要由乙酸、丁酸、己酸、辛酸、苯甲酸、癸酸、乳酸等酸類物質以及少量的酮類和醇類物質構成，其中乙酸、己酸、辛酸、乳酸峰面積響應值較強，說明樣品酸味、干酪味濃郁。干酪乳桿菌LC577發酵乳中丁二酮、乙偶姻含量較少，而且該2 種物質香氣主要表現為奶油香氣，說明干酪乳桿菌LC577發酵乳奶油香氣較弱[22-24]，并且干酪乳桿菌LC577發酵乳以短鏈脂肪酸為主。通過以上香氣分析可以判斷出干酪乳桿菌LC577發酵乳香氣整體上表現為酸奶酪香氣。

圖4 干酪乳桿菌LC577發酵乳的氣相色譜-質譜圖Fig.4 Gas chromatogram-mass spectrometric analysis of fermented milk with Lactobacillus casei LC577

表1 干酪乳桿菌LC577發酵乳主要風味物質的峰面積響應值及香氣描述Table1 Peak area response values and aroma descriptions of mainflavor compounds in fermented milk with Lactobacillus caseiLC577

2.5 干酪乳桿菌LC577的耐酸耐膽鹽實驗

由表2可知，干酪乳桿菌LC577在pH 2.5的MRS培養基中孵育4h的存活率達106.06%，活菌數有所增加，在含有3 g/L膽鹽的MRS培養基中培養4h存活率為13.60%，說明干酪乳桿菌LC577具有很強的耐酸能力和較強的耐膽鹽能力。能否耐受酸脅迫和堿脅迫是乳酸菌能否以活菌形式到達人體腸道并發揮作用的關鍵指標，體外耐酸耐膽鹽實驗是評價益生菌耐酸耐膽鹽能力的常用手段[25-26]。干酪乳桿菌LC577較強的耐酸耐膽鹽能力有利于其到達腸道并發揮益生作用。

表2 干酪乳桿菌LC577的耐酸耐膽鹽實驗結果Table2 Acid and bile salt tolerance of Lactobacillus casei LC 577

3 結 論

近幾十年來，在日本、美國及歐洲等發達國家，益生菌的概念早已深入人心。目前，日本、歐洲的功能性發酵乳酸菌飲料在乳制品市場的比例已達到80%，北美約為30%。日本主要乳制品公司均在國家支持下長期開展益生菌研究，益生菌產業發展取得顯著成績。為了降低國民健康費用支出，日本鼓勵公眾食用健康食品以降低患病風險，因此，對益生菌的研究投入仍在進一步增加。隨著我國人民生活水平的逐漸提高，對于食品健康的需求日益增長，益生菌市場需求逐步擴大，因此開發自有知識產權的益生菌不僅符合我國市場需求，同時對于提高我國公共健康水平、降低國民健康費用支出具有重要意義。

干酪乳桿菌常見于傳統發酵乳制品中，具有悠久的食用歷史，屬于乳桿菌屬，存在于人的口腔、腸道內含物、大便及陰道中，也常常出現在乳制品、飼料及面團中。目前，已有部分干酪乳桿菌被鑒定為益生菌，如干酪乳桿菌Zhang[27-28]、干酪乳桿菌Shirota[29]和干酪乳桿菌CRL431[30]等。近年來，國內外學者對干酪乳桿菌進行的研究發現，其具有調節腸道菌群[31]、抗癌[32]等作用。

本研究通過對西藏靈菇樣品進行菌株分離純化，得到一株干酪乳桿菌LC577，進一步研究發現，其具有良好的產酸特性和發酵產香能力，適宜作為酸乳發酵劑使用，同時具有良好的耐酸耐膽鹽能力，具有良好的益生菌特性，因此干酪乳桿菌LC577具有良好的應用前景。