嗜酸乳桿菌LA-G80發酵培養基的優化

陳 齊，馬章獻，鄭建豐*，韓 迪

（潤盈生物工程（上海）有限公司，上海 201700）

嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）屬于革蘭氏陽性細菌，具有多種生理功能[1-3]，如維持腸道菌群平衡、增強免疫力[4-5]、抑制有害菌生長[6]、控制膽固醇水平等作用[7-8]。嗜酸乳桿菌是功能性食品中的益生菌種之一[9]，獲得美國食品藥品監督管理局和我國衛生部授權。嗜酸乳桿菌培養過程中對環境及營養的要求較高[10]，研究高密度生產所需的培養基配方、培養工藝[11]、提高發酵活菌水平[12]是制備高活菌數嗜酸乳桿菌菌粉的關鍵。本研究利用單因素試驗、正交試驗、最陡爬坡試驗及響應面優化等方法[13-14]對嗜酸乳桿菌LA-G80的培養工藝進行優化研究，得到嗜酸乳桿菌LA-G80發酵的最佳培養基組成及培養條件，為企業高質量、高活菌水平生產提供一定參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

嗜酸乳桿菌LA-G80分離自人體腸道菌群，由潤盈生物工程（上海）有限公司研發中心實驗室乳酸菌菌種資源庫提供。

MRS液體培養基，按照GB 4789.35—2012《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》[15]的方法配制。

1.2 儀器與設備

JH UV-2102C紫外-可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；BioFlo?/CelliGen 115?生物反應器 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化及種子培養

菌種活化：取嗜酸乳桿菌LA-G80脫脂乳凍干管接入MRS液體培養基中，37℃培養12h，活化3 代。

種子培養：將活化后的菌種按體積分數2%接種到裝有200 mL MRS培養基的250 mL三角瓶中，置于37℃培養箱中，普通培養8h。

1.3.2 嗜酸乳桿菌LA-G80三角瓶發酵及發酵液活菌計數

將達標的種子按體積分數2%接種到裝有200 mL培養基的250 mL三角瓶中，置于37℃培養箱中，普通培養12h。發酵液活菌計數采用稀釋傾注培養的方式，參照GB 4789.34—2012《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 雙歧桿菌的鑒定》[16]。

1.3.3 嗜酸乳桿菌LA-G80培養基成分優化

以MRS液體培養基作為起始培養基，選擇添加量均為20 g/L的蔗糖、大豆低聚糖、低聚半乳糖、海藻糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、乳糖、麥芽糖、大豆纖維素作為碳源，進行碳源優化實驗；選擇添加量均為10 g/L的牛肉浸粉、酵母粉、牛骨蛋白胨、胰蛋白胨、魚蛋白胨、脫鹽乳清粉、酪蛋白胨、乳清粉、酵母蛋白胨進行氮源優化實驗；選擇添加量均為0.2 g/L的天冬氨酸、亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、丙氨酸、精氨酸、半胱氨酸和組氨酸進行氨基酸優化實驗。在三角瓶中進行實驗，于37℃普通培養12h進行發酵液活菌計數，初步確定培養基成分。

在上述優化后的培養基基礎上，分別添加5 g/L花生粉646、花生蛋白粉542、豆粕粉850、豆餅粉742、大豆蛋白粉858、大豆蛋白粉740、蛋白粉MZ9508、棉籽餅粉MZ9541、小麥胚芽粉9 種營養豐富的粗料，考察發酵液活菌數，確定嗜酸乳桿菌LA-G80培養基中主要成分的最優配比。

1.3.4 嗜酸乳桿菌LA-G80培養基主成分比例優化

根據培養基成分優化結果，選擇效果最好的碳源、氮源及粗料3 種因素進行最陡爬坡試驗及中心組合設計（central composite design，CCD），進行響應面擬合優化分析，得到碳源、氮源及粗料的最佳添加量。

1.3.5 嗜酸乳桿菌LA-G80三角瓶培養條件優化

考察不同培養溫度、初始pH值和接種量對嗜酸乳桿菌LA-G80生長情況的影響，確定較優的三角瓶培養條件。

1.3.6 發酵罐驗證

進行5 L規模小試發酵實驗，將達標的種子接種到裝有4 L培養基的5 L罐中，恒溫（37℃）及攪拌（100 r/min）條件下培養14h，取樣檢測發酵液活菌數，驗證優化后的培養基配方及培養條件。

1.4 數據處理

實驗均重復測定2 次，取平均值。采用WPS 2016軟件對培養基成分優化實驗數據進行匯總及分析，利用Design Expert 8.0軟件對培養基主成分比例優化實驗數據進行方差分析、響應面預測及繪圖。

2 結果與分析

2.1 嗜酸乳桿菌LA-G80培養基優化結果

2.1.1 碳源優化結果

碳源是培養基中主要的能量來源，碳源的充足與多樣性影響菌體的生長速率與菌體形態，多種碳源綜合使用有利于菌體的均衡生長，是影響發酵液活菌數和凍干粉質量的重要因素。

圖1 不同碳源（20 g/L）對嗜酸乳桿菌LA-G80發酵液活菌數的影響Fig.1 Effect of different carbon sources(20 g/L)on the viable count of Lactobacillus acidophilus LA-G80 fermentation broth

由圖1可知，以葡萄糖、麥芽糖或大豆低聚糖為碳源時，嗜酸乳桿菌LA-G80生長效果較好，對三者進行正交試驗。

由表1可知，根據3 種碳源極差值的區別得到3 種碳源的影響程度為葡萄糖＞麥芽糖＞大豆低聚糖，最優組合為葡萄糖添加量40 g/L、麥芽糖20 g/L、大豆低聚糖10 g/L。按照最優組合的碳源添加量進行實驗，嗜酸乳桿菌LA-G80的發酵液活菌數最高可達5.9×108CFU/mL。

表1 嗜酸乳桿菌LA-G80碳源優化正交試驗Table1 Orthogonal array design with experimental results for optimization of mixed carbon sources for Lactobacillus acidophilus LA-G80

2.1.2 氮源優化結果

氮源是細胞合成核苷酸和蛋白質的重要原料物質，充足且易利用的氮源有利于細胞的快速分裂；蛋白胨類物質富含氨基酸、多肽、糖類、脂肪和生長因子等成分，能很好地促進嗜酸乳桿菌LA-G80的生長。

圖2 不同氮源（10 g/L）對嗜酸乳桿菌LA-G80發酵液活菌數的影響Fig.2 Effect of different nitrogen sources(10 g/L)on the viable count of Lactobacillus acidophilus LA-G80 fermentation broth

選擇9 種不同氮源進行氮源優化實驗，MRS對照組碳源按照優化后的比例進行配制。由圖2可知，牛肉浸粉、胰蛋白胨和酵母蛋白胨為氮源時，嗜酸乳桿菌LA-G80培養效果較好。

在微生物生長過程中，多種氮源的復合使用更有利于細胞生長，考察復合氮源對嗜酸乳桿菌LA-G80生長的影響，設計正交試驗。由表2可知，3 種氮源的影響順序為牛肉浸粉＞胰蛋白胨＞酵母蛋白胨，較優組合為牛肉浸粉添加量15 g/L、胰蛋白胨10 g/L、酵母蛋白胨15 g/L。按照最優組合的碳源及氮源添加量進行實驗，發酵液活菌數最高可達7.9×108CFU/mL。

表2 嗜酸乳桿菌LA-G80氮源優化正交試驗Table2 Orthogonal array design with experimental results for optimization of mixed nitrogen sources for Lactobacillus acidophilus LA-G80

2.1.3 氨基酸優化結果

嗜酸乳桿菌LA-G80菌體細胞內缺乏各種必需的生物合成系統，依賴于培養基提供某些生長必需氨基酸，且可提高氮源利用率。在有氨基酸的培養過程中，乳酸菌可吸收相容性物質，以此加強水分子與胞內生物大分子物質的親和力，進而保持蛋白質結構和酶活性，從而提高菌株凍干過程的存活率。在上述優化的基礎上，選擇9 種氨基酸，添加量均為0.2 g/L，考察嗜酸乳桿菌LA-G80發酵液活菌數。

圖3 不同氨基酸（0.2 g/L）對嗜酸乳桿菌LA-G80發酵液活菌數的影響Fig.3 Effect of different amino acids(0.2 g/L)on the viable count of Lactobacillus acidophilus LA-G80 fermentation broth

由圖3可知，與對照組相比，添加0.2 g/L天冬氨酸、絲氨酸、丙氨酸均能促進嗜酸乳桿菌LA-G80的生長，對三者添加量進行組合試驗，進一步確定3 種氨基酸的較適添加量。

由表3可知，隨著3 種氨基酸添加量的增多，嗜酸乳桿菌LA-G80發酵液活菌數先上升后下降，最高發酵液活菌數為9.9×108CFU/mL，此時3 種氨基酸添加量均為0.16 g/L。

表3 嗜酸乳桿菌LA-G80培養基氨基酸優化組合試驗設計及結果Table3 Combined test design with experimental results for optimization of mixed amino acids for Lactobacillus acidophilus LA-G80

2.1.4 粗料優化結果

表4 嗜酸乳桿菌LA-G80培養基粗料（5 g/L）優化結果Table4 Selection of optimal solid culture substrate(5 g/L)for Lactobacillus acidophilus LA-G80

在微生物培養中，粗料作為一類營養豐富、含促生長因子、價格便宜的物質被大量利用。由表4可知，添加5 g/L 9 種粗料均對嗜酸乳桿菌LA-G80的生長有促進作用，其中添加豆餅粉742和花生蛋白粉542的效果最好，發酵液活菌數可分別達到16.2×108、15.3×108CFU/mL，且菌體形態更加均一，有利于提高菌體密度和菌泥產量。

2.2 響應面法優化嗜酸乳桿菌LA-G80培養基主成分比例

通過碳源、氮源及粗料添加試驗后，確定葡萄糖、牛肉浸粉及豆餅粉742添加量為3 個最顯著因素，進行最陡爬坡試驗，確定中心點。

由表5可知，隨著葡萄糖、牛肉浸粉和豆餅粉742添加量的增加，嗜酸乳桿菌LA-G80活菌密度先上升后下降，在第5組試驗中達到最大，此時葡萄糖添加量為4.0%、牛肉浸粉添加量1.7%、豆餅粉742添加量0.5%。以這3 個因素添加量為中心點，以葡萄糖添加量（A）、牛肉浸粉添加量（B）、豆餅粉742添加量（C）為自變量，嗜酸乳桿菌LA-G80菌體密度（OD600nm）為響應值（Y），利用Design-Expert 8.0軟件設計3因素5水平的CCD，具體數據如表6～7所示。

表5 嗜酸乳桿菌LA-G80培養基成分優化最陡爬坡試驗設計及結果Table5 Steepest ascent design with experimental results for optimization of medium composition for Lactobacillus acidophilus LA-G80

表6 嗜酸乳桿菌LA-G80培養基成分CCD及結果Table6 CCD with experimental results for optimization of medium composition for Lactobacillus acidophilus LA-G80

表7 響應面試驗結果方差分析Table7 Analysis of variance of quadratic polynomial regression model

對表6的數據進行方差分析，可得擬合方程：Y=12.61＋0.37A＋1.49B＋0.52C＋0.01AB＋0.31AC-0.31BC-1.26A2-1.79B2-1.55C2。采用Design-Expert 8.0軟件分析，所得模型的決定系數R2為0.933 0，校正后為0.983 0，表明此模型能解釋實驗中98.30%的情況。由表7可知，失擬項P值為0.059 6＞0.05，失擬項對于誤差不顯著，說明回歸模型可信，能較好地解釋嗜酸乳桿菌LA-G80菌體密度的變化，因此可利用該模型對嗜酸乳桿菌LA-G80的高密度發酵培養情況進行預測。

分析二次多項方程，利用Design Expert 8.0軟件得到二維等高線和三維立體圖，等高線圖越接近橢圓表示交互作用越強，等高線的稀疏表示響應面圖形的平陡。每個響應面三維分析圖和對應的等高線圖分別為當1 個變量保持0水平時，另2 個獨立變量之間的交互作用。由圖4～6可知：葡萄糖與牛肉浸粉、葡萄糖與豆餅粉742、牛肉浸粉與豆餅粉742對嗜酸乳桿菌LA-G80發酵液菌體密度的交互作用顯著（P＜0.05）；在一定范圍內，隨著葡萄糖、牛肉浸粉和豆餅粉742添加量的增加，發酵液菌體密度隨之增加，在達到一定程度后，各因素添加量繼續增加，發酵液菌體密度逐漸減小，說明它們之間對嗜酸乳桿菌LA-G80發酵液菌體密度的影響不是簡單的線性關系，只有在3 個因素添加量適宜的條件下，嗜酸乳桿菌LA-G80的發酵液菌體密度才會達到最大值。采用響應面法優化得到培養基主成分最佳添加量為葡萄糖41.5 g/L、牛肉浸粉18.64 g/L、豆餅粉7 425.48 g/L，其余培養基成分按照優化后的量進行添加；使用該模型預測的最大菌體密度（OD600nm）為13.928 2。37℃培養

圖4 葡萄糖與牛肉浸粉對嗜酸乳桿菌LA-G80發酵液菌體密度交互作用的等高線及響應面圖Fig.4 Response surface and contour plots showing the interactive effect of glucose and beef extract powder on cell density of Lactobacillus acidophilus LA-G80

圖5 葡萄糖與豆餅粉742對嗜酸乳桿菌LA-G80發酵液菌體密度交互作用的等高線及響應面圖Fig.5 Response surface and contour plots showing the interactive effect of glucose and soybean cake powder on cell density of Lactobacillus acidophilus LA-G80

圖6 牛肉浸粉與豆餅粉742對嗜酸乳桿菌LA-G80發酵液菌體密度交互作用的等高線及響應面圖Fig.6 Response surface and contour plots showing the interactive effect of beef extract powder and soybean cake powder on cell density of Lactobacillus acidophilus LA-G80

12h，實際菌體密度（OD600nm）為13.75，可見該模型能夠較好預測嗜酸乳桿菌LA-G80的菌體生長情況。

2.3 嗜酸乳桿菌LA-G80三角瓶培養條件優化結果

由表8可知，3 種因素的影響順序為培養溫度＞起始pH值＞接種量，最優培養條件為溫度37℃、起始pH 6.0、接種量2%，在此條件下嗜酸乳桿菌LA-G80活菌數達到19.9×108CFU/mL。

表8 嗜酸乳桿菌LA-G80三角瓶培養條件優化設計及結果Table8 Experimental design with results for optimization of shake flask culture conditions for Lactobacillus acidophilus LA-G80

2.4 5 L發酵罐發酵實驗結果

嗜酸乳桿菌LA-G80高密度培養過程中，不適宜的pH值會抑制酶活性，適宜的恒定pH值可以延長對數生長期、減輕過酸抑制作用、提高菌體密度，從而增加菌泥產量。在5 L罐發酵過程中，保持恒定pH 5.5，配制MRS培養基及優化培養基，在5 L罐中按照相同的培養條件培養嗜酸乳桿菌LA-G80。結果表明，利用優化后的培養基培養，嗜酸乳桿菌LA-G80在5 L發酵罐中的發酵液活菌數可達42.2×108CFU/mL，約為MRS培養基的10 倍。

3 結 論

近年來，隨著人們生活水平的提高，對食品及保健品的需要越來越強烈，而嗜酸乳桿菌作為人體腸道菌群中主要的有益菌株[17-18]，對其研究也較多。嗜酸乳桿菌對于維持腸道菌群平衡[19]、保持腸道健康具有明顯作用[20-21]，因此生產出具有高生物活性的嗜酸乳桿菌產品變得更加重要。本研究采用正交試驗設計、中心組合試驗設計和響應面分析相結合的方法，確定嗜酸乳桿菌LA-G80高密度培養過程中最顯著影響因子的最佳添加量，為其高質量、高密度培養提供了一定參考。

嗜酸乳桿菌LA-G80高密度培養過程中的最優培養基組成為葡萄糖添加量41.5 g/L、麥芽糖20 g/L、大豆低聚糖10 g/L、牛肉浸粉18.64 g/L、胰蛋白胨10 g/L、酵母蛋白胨15 g/L、吐溫-80 1 mL/L、K2HPO4·7H2O 2 g/L、N a A c·3 H2O 5 g/L、檸檬酸三銨2 g/L、MgSO4·7H2O 0.25 g/L、MnSO·4H2O 0.05 g/L、天冬氨酸0.16 g/L、丙氨酸0.16 g/L、絲氨酸0.16 g/L、花生蛋白粉5 425 g/L、豆餅粉7 425.48 g/L。嗜酸乳桿菌LA-G80的較適培養條件為接種量2%、初始pH 6.0、恒定pH 5.5、恒溫37℃。進行5 L發酵罐驗證實驗，結果表明，菌體形態均一，發酵液活菌數最高達42.2×108CFU/mL，約為MRS培養基的10 倍。利用優化后的培養基組成及培養條件進行多次1 t發酵罐實驗，結果表明，發酵液活菌數比當前生產水平提高1 倍，凍干粉活菌數和產量均提高50%以上，產品具有更高的生物活性。合理的培養基構成及粗料的使用使得培養基中營養更加均衡、營養成分更加豐富，且粗料可促進細胞分裂，有利于生產出具有高生物活性的菌粉，且菌粉的食用及保健價值更高，能夠降低成本，提高效益。