低致敏牛乳清蛋白的酶法制備

李 燕，伊 洋，石 徑，王世杰，羅永康,*

（1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；2.中國農業大學 北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，北京 100083；3.石家莊君樂寶乳業有限公司，石家莊 050299）

β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-LG）占牛乳清蛋白的50%[1]，對胃酸和蛋白酶有部分抵抗性，經過消化道后仍有部分蛋白結構保持完整，因此是乳清蛋白中最主要的過敏原之一[2-3]。人乳中不含β-LG，調查發現，乳蛋白過敏人群中對β-LG過敏的人占82%[4]。如何采用適宜的方案對乳蛋白進行改性，在保留乳蛋白本身營養價值的同時有效降低β-LG的抗原性具有重要的現實意義。

蛋白酶水解是改變牛乳蛋白抗原性最有效的方法之一，其操作過程條件比較溫和，對牛乳中的營養物質破壞相對較少，并且酶解產生的短肽更有利于人體吸收。已有研究報道，蛋白酶解可降低β-LG的過敏原性，并提高其功能性[5]。盡管大部分乳蛋白過敏患者可以接受深度水解的配方乳粉，但仍然有小部分人對蛋白水解物有過敏反應，如過敏性皮炎[6]，這可能是由于水解物中的某些小肽段仍具有抗原性[7]。酶解改性能夠破壞乳蛋白的非線性表位與線性表位，抗原表位是否保留很大程度上取決于乳蛋白水解度及酶解使用的酶種類[8]。當蛋白酶水解度合適時，可以破壞乳清蛋白的抗原線性表位，降低其致敏性；但當水解度過小時，反而可能暴露乳清蛋白內部的抗原表位，導致其抗原性有所增強；而深度水解可以將乳清蛋白水解成很小的肽段或是氨基酸，從而降低其抗原性，但是深度水解的酶解物一般具有比較嚴重的苦味，這可能會影響水解產物的應用。因此選擇適宜的蛋白酶并確定恰當的水解條件是蛋白質酶法改性的關鍵。

本研究以濃縮乳清蛋白粉80（whey protein concentrate 80，WPC80）作為酶解原料，通過酶解技術降低乳清蛋白中β-LG的抗原性，以水解度、分子質量分布及抗原性為主要檢測指標，篩選β-LG抗原性較低的酶解產物進行苦味評價，確定最適宜的蛋白酶及酶解條件，為制備低致敏乳清蛋白產品提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

WPC80 君樂寶乳業集團。

堿性蛋白酶、胰蛋白酶、風味蛋白酶 丹麥Novozymes公司；β-LG、辣根過氧化物酶（horseradish p e r o x i d a s e，H R P）標記羊抗兔免疫球蛋白G（i m m u n o g l o b u l i n G，I g G）、鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）美國Sigma公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）美國Amresco公司；多克隆抗體（兔抗β-LG血清）上海裕信生物科技有限公司；其他試劑均為分析純 北京化學試劑公司。

1.2 儀器與設備

MultiskanMK3酶標儀 美國Thermo-Scientific公司；ZW-A微量振蕩器 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；Vortex-Genie 2漩渦混合器 美國Scientific Industries公司；3590 96孔酶標板 美國Corning公司；FD-1PF冷凍干燥機 北京德天佑科技發展有限公司；UNICO-2600A紫外-可見分光光度計 美國Unico公司；CXTH-3000高效液相色譜儀 北京創新通恒有限公司；TGL-16A冷凍離心機 長沙儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳清蛋白水解

將WPC80配制成質量濃度15 g/100 mL的溶液，用堿性蛋白酶、胰蛋白酶及復合酶進行酶解，以加酶量為5 000 U/g（酶活/底物質量）加入蛋白酶，酶解條件如表1所示，酶解過程中用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH溶液維持穩定的pH值。酶解時間均為3h，每隔30 min各取樣1 次，將得到的樣品用沸水浴滅酶10 min，冷卻后離心（12 000 r/min，10 min）。將所得上清液的pH值調至中性，真空冷凍干燥后于-20℃貯藏。

表1 酶反應條件和酶活力Table1 Reaction conditions and activities of various enzymes

1.3.2 水解度測定

參照Nielsen等[9]的方法，并稍作修改。稱取200 mg OPA溶解于5 mL無水乙醇中，加入150 mL 0.3 mol/L四硼酸鈉溶液、250 mg十二烷基硫酸鈉及200 mg二硫蘇糖醇，定容至250 mL，待用。將WPC80酶解物稀釋600 倍，取400 μL加入4 mL上述OPA溶液中，振蕩混勻，室溫反應2 min，測定340 nm波長處的光密度（optical density，OD）（OD340nm）。配制濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L的L-絲氨酸溶液，與上述OPA溶液反應2 min，測定OD340nm，繪制標準曲線。水解度按下式計算。

式中：c為由標準曲線計算所得L-絲氨酸濃度/（mmol/L）；V為乳清蛋白酶解液體積/L；m為WPC80質量/g。

1.3.3 分子質量分布測定

參考Xie Ningning等[10]的方法，采用高效液相色譜法檢測WPC80酶解物的分子質量分布，并稍作修改。配制5 mg/mL WPC80酶解物溶液，0.45 μm濾膜過濾待用。

高效液相色譜條件：色譜柱為COSMOSIL 5 C18-PAQ（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A為含0.1 g/100 mL三氟乙酸的超純水，流動相B為含0.1 g/100 mL三氟乙酸的乙腈；柱溫40℃，進樣量25 μL，檢測波長214 nm，流速0.5 mL/min；洗脫條件：55%流動相A，45%流動相B，時間40 min。

以細胞色素C（1 2 3 6 2 D a）、抑肽酶（6 511.4 Da）、桿菌肽（1 423 Da）、Gly-Gly-Tyr-Arg（四肽，451 Da）和Gly-Gly-Gly（三肽，189 Da）作為標準物。

1.3.4 間接競爭酶聯免疫吸附法確定最佳抗原包被質量濃度與兔抗血清稀釋倍數

采用棋盤法確定β-LG最佳包被質量濃度與兔抗血清最佳稀釋倍數。β-LG稀釋為不同質量濃度后，以每孔100 μL加入96孔酶標板中，4℃冷藏過夜；同時將兔抗血清進行梯度稀釋，與等體積0.01 mol/L 磷酸緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）混合，4℃冷藏過夜；將96孔酶標板溶液倒出后，每孔用250 μL 0.01 mol/L PBS洗滌3 次，晾干后，每孔加入100 μL封閉液，37℃溫育1h后洗板。將梯度稀釋的兔抗血清溶液加入96孔酶標板內，每孔100 μL，37℃溫育1h后洗板。HRP-羊抗兔IgG稀釋10 000 倍后加入96孔酶標板中，每孔100 μL，37℃溫育1h后洗板。將顯色液3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）溶液加入96孔酶標板內，每孔100 μL，37℃反應10 min；每孔加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止液。測定每孔OD340nm，OD340nm接近1.0時抗原抗體反應最敏感，由此確定最佳抗原β-LG包被質量濃度和兔抗血清稀釋倍數。

1.3.5β-LG抗原性測定

使用間接競爭酶聯免疫吸附法[11-12]測定水解乳清蛋白中β-LG的抗原性，具體步驟為：1）抗原包被：配制1.0 μg/mLβ-LG溶液，加入96孔酶標板內，每孔100 μL，4℃冷藏過夜；2）抗原與抗體反應：配制0.5 mg/mL WPC80酶解物溶液，與等體積稀釋后的兔抗血清混合，4℃冷藏過夜；3）封閉：倒出96孔酶標板中溶液后，每孔用250 μL 0.01 mol/L PBS洗滌3 次，晾干后，每孔加入100 μL封閉液，37℃溫育1h后洗板；4）加樣：將2）中配制的溶液加入96孔酶標板內，每孔100 μL，37℃溫育1h后洗板；5）加酶標二抗：HRP-羊抗兔IgG稀釋10 000 倍后加入96孔酶標板中，每孔100 μL，37℃溫育1h后洗板；6）顯色：將顯色液TMB溶液加入96孔酶標板內，每孔100 μL，37℃反應10 min；7）終止反應：每孔加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止液；8）OD測定：用酶標儀檢測OD450nm和OD630nm，每孔OD=OD450nm-OD630nm。

標準曲線的制作：a）將系列質量濃度（0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 μg/mL）β-LG溶液經酶聯免疫吸附法測定，將各質量濃度溶液對應的OD轉化為B/B0，其中B0為無抗原競爭體系的OD，B為有抗原抑制時的OD，以B/B0為縱坐標，以β-LG抗原相應質量濃度（ρ）的對數（lgρ）為橫坐標，制作標準曲線；b）標準曲線的Logit線性回歸：選擇標準曲線上B/B0和lgρ呈最明顯線性相關的部分，計算標準曲線上每個標準點的Logit（B/B0），以Logit（B/B0）作為縱坐標再制作對應于lgρ的標準曲線，對Logit（B/B0）進行線性回歸分析，得出線性回歸方程及相關系數；c）抗原性的表示：根據待測樣品在酶聯免疫吸附法中測得的B/B0，計算待測樣品中β-LG的抗原性（以等價的質量濃度表示）。

1.3.6 苦味評價

參考李學林等[13]的方法，并稍作修改。以WPC80、丹麥3080深度水解乳清蛋白粉作為參比品。將WPC80的苦味值定為0，丹麥3080深度水解乳清蛋白粉苦味值定為4。將參比品和不同酶解方案中抗原性最低的樣品配成質量濃度為10 g/100 mL的溶液，用于苦味評價。

取20 mL參比溶液于紙杯中，在紙杯上標出溶液的苦味值，評價者將其含于口中15 s，測試時口腔做漱口動作，以便于舌根及舌側的苦味感受區可以充分感受到苦味，吐出后用清水漱口5 次，直到口腔內無味道。

取20 mL樣品溶液于紙杯中，對比參比溶液，評價者根據表2的描述確定苦味等級并記錄，再根據同一級別內不同樣品相對苦味的大小確定具體的苦味值并記錄。清水漱口5 次，直到口腔內無味道，再進行下一個樣品的測定。此外，評價者對樣品進行評價時，均采用低苦度向高苦度的方法對樣品進行測試。

表2 苦味評價參照表Table2 Criteria for bitter taste evaluation

1.4 數據處理

實驗數據以平均值±標準差表示，每組實驗重復3 次，使用Excel 2010軟件進行處理并作圖，運用SPSS 20.0軟件進行差異分析和相關性分析。

2 結果與分析

2.1 WPC80酶解產物的水解度測定

由圖1可知，酶解時間0.5h內，4 種酶解方案的酶解速率最快，后期趨于平穩。復合酶的酶解能力在酶解1.0h后明顯高于單酶，這可能是由于多種酶復合水解時，酶的作用位點更加廣泛，酶解能力因此增強[14]。堿性蛋白酶＋胰蛋白酶組的水解度在2.0h內與堿性蛋白酶＋胰蛋白酶＋風味蛋白酶組基本相同，2.0～3.0h內堿性蛋白酶＋胰蛋白酶＋風味蛋白酶組的水解度略高。

圖1 不同酶解方案WPC80酶解產物的水解度Fig.1 Hydrolysis degrees of WPC80 hydrolysates with different proteases

2.2 WPC80酶解產物的分子質量分布

由圖2可知，與原料乳相比，酶解后的WPC80中小于1 000 Da的組分含量顯著增加，大于2 000 Da的組分含量顯著減少。堿性蛋白酶、堿性蛋白酶＋胰蛋白酶及堿性蛋白酶＋胰蛋白酶＋風味蛋白酶組WPC80酶解產物的分子質量分布相近，且產物小分子質量組分含量明顯小于胰蛋白酶組。van Beresteijn等[15]發現，乳清蛋白水解肽分子質量低于3 400 Da時不容易引起過敏反應。酶解2.5h時，堿性蛋白酶、堿性蛋白酶＋胰蛋白酶及堿性蛋白酶＋胰蛋白酶＋風味蛋白酶組WPC80酶解產物中，分子質量小于3 000 Da的組分分別占96.63%、93.10%和95.50%，高于其他酶解時間點，其中分子質量小于500 Da組分的含量分別占44.43%、50.68%和56.77%，分子質量500～1 000 Da的組分分別占32.04%、23.76%和21.84%，分子質量1 000～2 000 Da的組分分別占16.66%、14.95%和13.72%。Carvalho等[16]研究發現，乳清蛋白水解肽誘發免疫反應的最小分子質量在3 000～5 000 Da范圍內，本研究中酶解2.5h時此范圍內的水解肽相對較少。

圖2 不同酶解方案WPC80酶解產物的分子質量分布Fig.2 Molecular mass distribution of WPC80 hydrolysates with different proteases

2.3 β-LG最佳抗原包被質量濃度與兔抗血清最佳稀釋倍數

由表3可知，OD340nm接近1.0時抗原抗體反應最敏感，因此確定抗原β-LG的最佳包被質量濃度為1.0 μg/mL，兔抗血清稀釋倍數為1∶25 000。

表3 不同β-LG包被質量濃度和兔抗血清稀釋倍數時的OD340 nmTable3 Determination of coating concentration of β-LG antigen and rabbit anti-β-LG serum dilution

2.4 β-LG的抗原性

由圖3可知，蛋白酶水解能夠顯著降低WPC80中β-LG的抗原性，但不能完全消除，這與Yao Mingjing等[17]的研究結果相同。Rosendal等[18]對市售12 種水解乳配方進行研究，發現其中仍有殘余的β-LG抗原性，水解程度低的配方乳中β-LG的殘留抗原性更高。堿性蛋白酶組水解2h時水解產物中的β-LG抗原性最低，為0.67 μg/mL；堿性蛋白酶＋胰蛋白酶組和堿性蛋白酶＋胰蛋白酶＋風味蛋白酶組水解2.5h時的β-LG抗原性最低，分別為0.79、1.50 μg/mL；胰蛋白酶組的β-LG抗原性隨酶解過程不斷下降，在3h時降至2.27 μg/mL。堿性蛋白酶組與堿性蛋白酶＋胰蛋白酶組水解后殘余的β-LG抗原性明顯高于另外2 種酶解方案，但是堿性蛋白酶組酶解不同時間時的殘余β-LG抗原性波動較大，這與江連洲等[19]的研究結果一致，這可能是由于隨著酶解過程的進行，乳蛋白結構發生變化，使內部的抗原表位暴露，從而引起抗原性的波動。

2.5 WPC80酶解產物的苦味評價

由表4可知，胰蛋白酶酶解3.0h產物、堿性蛋白酶＋胰蛋白酶及堿性蛋白酶＋胰蛋白酶＋風味蛋白酶酶解2.5h產物苦味值較低，且無顯著性差異（P＞0.05），評價者描述這3 種溶液（10 g/100 mL）的苦味很淡。堿性蛋白酶酶解2.0h產物苦味值較高，有明顯的苦味。含有疏水性氨基酸的短肽是酶解產物苦味的主要來源[20]，研究表明，胰蛋白酶水解得到的肽段多以Arg和Lys為C末端殘基，產生的疏水肽較少，因此苦味較低[21]，而堿性蛋白酶作用部位是羧基側芳香族或疏水性氨基酸，疏水基團暴露，水解物的苦味增強[22]。

表4 不同酶解方案WPC80酶解產物及對照樣品的苦味評價表Table4 Bitter taste evaluation of WPC80 hydrolysates with different proteases and control samples

3 結 論

堿性蛋白酶、堿性蛋白酶＋胰蛋白酶及堿性蛋白酶＋胰蛋白酶＋風味蛋白酶組WPC80酶解產物的分子質量明顯低于胰蛋白酶組，其中堿性蛋白酶組和堿性蛋白酶＋胰蛋白酶組分別在酶解2.0、2.5h時殘余β-LG抗原性達到最低，分別為0.67、0.79 μg/mL，但堿性蛋白酶組酶解產物苦味較明顯，因此選擇堿性蛋白酶＋胰蛋白酶制備低抗原性WPC80酶解物，其酶解條件為底物質量濃度15 g/100 mL、加酶量5 000 U/g（50%堿性蛋白酶＋50%胰蛋白酶）、酶解溫度48℃、酶解pH 8.0、酶解時間2.5h。