術中冰凍優化彈力纖維染色在肺癌浸潤程度診斷中的成效分析

陳惠玉 林潔 陳小巖

作者單位：福建省立醫院病理科，福建 福州 350001

肺癌是常見的胸部惡性腫瘤，近年來其發病率逐年上升[1-2]。2009年，國際抗癌聯盟發布第7版腫瘤TNM分期標準（Tumor Node Metastasis），著重強調肺癌胸膜侵犯在TNM分期中的作用，不論腫瘤大小，將侵犯臟層胸膜的腫瘤歸為T2期[3-4]。彈力纖維（elastic fibers, EFs）是肺內支氣管及肺泡結構的主要骨架[5]，當肺部發生病變時，EFs也會發生一定的改變[6]。病理上應用胸膜的EFs染色，能直觀地觀察腫瘤細胞是否到達或突破胸膜層，對肺癌臨床分期及在肺癌治療策略的制定和預后判斷中起重要作用[7-8]。彈力纖維Gomori醛復紅染色法完整過程約需時45～60分鐘，較長時間的制片染色過程在與冰凍診斷及制片技術的緊急原則權衡下，各大醫院常規病理工作中，肺組織的彈力纖維染色多于術后制作并診斷[9]。基于此，本文旨在探討優化彈力纖維染色技術是否適宜在術中冰凍進行，并為術中醫師的手術決策及時提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

組織標本所來源患者的診斷標準：（1）納入標準：于2018年全年臨床入院診斷為肺癌可疑（ICD-10編碼C34.9001）、收治于我院胸外科、臨床醫師為其開具術中冰凍申請、病理肉眼取材時可見可疑肺結節≤2 cm；（2）排除標準：冰凍肉眼取材時明確未取到肺被膜、冰凍切片HE染色后鏡下觀察明確診斷為浸潤性肺癌或為炎性病變的。2018年全年收集標本117例。男53例，女64例。年齡26～78歲，中位數為57歲。所有資料經醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

采用自身前后配對設計方法，對符合上述診斷標準的組織在術中冰凍時采用優化彈力纖維染色法進行制片和病理讀片診斷，術后相同組織待石蠟切片后進行彈力纖維Gomori醛復紅染色制片及病理診斷。

1.2.1 取材制片過程 首先，對新鮮肺組織將其進行取材，大小1.5 cm×1.5 cm左右，厚度為3 mm，注意取材時要保證同時取到可疑肺結節于鄰近肺被膜，然后使用OCT包埋劑（Optimal Cutting Temperature Compound）對其進行包埋，將其放置在LEICA CM 1950冰凍切片機中，待包埋劑稍凝固即可進行冰凍切片，切忌凍過頭，對標本進行連續切片2張，厚度約在6 μm。將切片迅速放入裝有AAF液（95%乙醇：40%甲醛：冰醋酸=17：2：1）的立式染缸中，固定數秒。隨后將已經固定的切片使用自來水速洗，取其中一張切片滴染蘇木素液1 min，接著使用濃度為1%的鹽酸乙醇迅速分化。進行溫水藍化和伊紅染色，使用酒精脫水、二甲苯透明化，中性樹膠行封片；另外一張切片進行改良后Gomori醛復紅染色。同一病例待病理醫師常規全面取材鏡檢后挑選適宜蠟塊進行術后彈力纖維染色。

1.2.2 染色過程 見表1。

1.2.3 研究中應用的試劑 彈力纖維染色試劑盒（產品編號：MST-8047/8048，批號1802068048，規格15 mL）。

1.2.4 觀察指標 所有組織切片遵循三級診斷制度，由住院病理醫師讀片并下初步診斷，主治病理醫師復片，如有疑問再由上級病理醫師（副高及以上）審核。本研究中陽性指相應染色方法制片后診斷結果為浸潤性，陰性指診斷結果為微浸潤或原位。

1.3 統計學方法

運用SPSS 19.0軟件包進行數據分析。采用配對計數資料的χ2檢驗進行統計學分析。將數據結果用“陽性”或“陰性”二分變量呈現，采用McNemar檢驗分析配對資料結果是否有差異，用Kappa值來度量測量結果的一致性。所有結果以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 鏡下觀察病理特點

切片中富含彈力纖維的組織如血管、肺被膜等呈深紫色波浪狀，背景呈不同程度的淡黃色，二者鏡下呈像無明顯分別，見圖1、圖2。

2.2 診斷結果

經病理學觀察顯示，使用術中冰凍優化彈力纖維染色，陽性患者23例，陰性94例，陽性率為19.66%。對相同組織進行術后石蠟切片彈力纖維Gomori醛復紅染色，陽性患者28例，陰性患者89例，陽性率為23.93%。采用配對計數資料的χ2檢驗，McNemar檢驗結果為P=0.063，兩法診斷結果無顯著差異。兩種方法的診斷吻合系數Kappa=0.875，P=0.000，說明兩種方法的吻合度有統計學意義且較強。見表2。

3 討論

圖1 術中冰凍優化彈力纖維染色顯微鏡下裁圖

圖2 術中冰凍優化彈力纖維染色顯微鏡下裁圖

表1 術中冰凍優化彈力纖維染色與術后石蠟切片彈力纖維Gomori 醛復紅染色方法比較

表2 應用兩種彈力纖維染色技術診斷肺癌浸潤程度的結果描述

冰凍切片技術是一種較為常用的術中病理診斷方法，由于其檢測迅速，因而能為手術操作提供較為可靠的依據，對于提高手術效果具有重要的作用[10]。冰凍切片作為一項條件因素要求嚴格的技術，臨床和病理醫師考慮術中冰凍切片診斷與術后石蠟切片診斷存在一定漏診率，故對于肺癌患者的彈力纖維染色常規采用術后石蠟切片Gomori醛復紅染色。如若將肺組織彈力纖維染色診斷結果提前至術中，將對術中醫師的手術決策及患者預后產生較大臨床意義。本次研究中，采用術后石蠟切片彈力纖維染色作為對比，研究結果顯示同一塊組織術中冰凍優化彈力纖維染色診斷結果與其無顯著差異，可見術中冰凍優化彈力纖維染色診斷準確性較高。并且，從診斷結果絕對值差異上看，二者的差異存在于術中冰凍優化彈力纖維染色診斷結果為陰性，而術后石蠟切片彈力纖維染色診斷為陽性，可能與取材數量范圍等原因有關。但這種漏診情況并不影響加做術中冰凍優化彈力纖維染色對臨床術中醫師手術范圍抉擇的指導價值。

與對照組的術后石蠟切片彈力纖維Gomori醛復紅染色比較，試驗組的術中冰凍優化彈力纖維染色方法部分步驟時間縮減，同時鏡下觀察舒適，顏色清晰，界限分明，將組織彈力纖維染色成深紫色，從而判定彈力纖維的完整性、是否斷裂，進而推斷肺癌有無浸潤[11]。二者鏡下呈像無明顯分別，術中冰凍優化彈力纖維染色達到理想的制片效果。我院病理科常規要求一例術中冰凍報告時限為30 min，開展肺癌術中冰凍優化彈力纖維染色能夠在規定時限內報送診斷結果，在最為恰當時刻為手術醫師提供診斷和手術參考依據，具有一定臨床意義。

在術中冰凍切片檢測中，除上述的制片質量、工作時間外，診斷結果還受檢測組織、取樣質量等因素影響[12]。因此，為保證術中冰凍優化彈力纖維染色診斷結果的準確性，必須強調術中肺癌組織取樣的規范性，同時還要求病理醫生取材、讀片的質量。

綜上所述，針對肺癌手術患者，保證病理切片和診斷質量前提下，采用術中冰凍優化彈力纖維染色，其準確率高，為臨床醫生的手術方式提供有力依據，增加手術醫生信心，避免患者二次手術，提高患者預后。