X射線熒光光譜法在藥品元素雜質分析中的應用

徐昕怡，劉 貞，洪小栩

1 國家藥典委員會，北京 100061；2 江西省藥品檢驗檢測研究院，南昌 330029

自2010年國際人用藥品注冊技術協調會（ICH）發布了Q3D 元素雜質指導原則以來，美國、歐盟進一步限制了藥品中的元素雜質水平[1，2]，藥品中元素雜質的控制越來越受到關注。X 射線熒光光譜（X-ray fluorescence spectrometry，XRF）是基于測量由初級X 射線激發的原子內層殼電子產生的特征X 射線光量子的一種儀器分析方法。可用于分析測定液體、粉末和固體材料樣品中不同元素產生的熒光X 射線波長（或能量）和強度，獲得元素組成與含量信息，達到定性和定量分析的目的，目前已在地質、冶金、材料、環境、工業等的無機分析領域得到了極其廣泛的應用[3]。盡管近年來XRF 在中藥元素成分分析以及鑒定評價方面已有不少報道[4-6]，但在其他藥物分析領域中的研究較少。本文綜述了近年來國內外XRF 在藥品元素雜質分析中的應用情況，旨在為藥品中元素雜質控制研究提供參考。

1 XRF 的分類和特點

XRF 具有分析速度快、檢測元素范圍廣、前處理簡便、無污染、成本低廉以及無損檢測等優點[7]，可用于各類樣品中主、次、痕量多元素同時測定。根據分光方式不同，XRF 可分為波長色散型（WDXRF）和能量色散型（EDXRF）。WDXRF 具有較高的分辨率，體積大，需要較強的光源和專用的晶體光學元件，因此僅限于實驗室中使用。實驗室級EDXRF 自20世紀60年代早期開始使用，隨著硬件和軟件的不斷發展，手持式及便攜式EDXRF 的研發在近三十年中逐漸深入，其性能接近于實驗室用EDXRF。根據X 射線出射、入射角度還可分全反射X 射線熒光光譜（TXRF）、掠出射X 射線熒光光譜（GEXRF）和掠入射X 射線熒光光譜（GI-XRF）等[8]。目前同時配備XRF 和ICP-MS 是國外分析實驗室的趨勢，利用XRF 分析含量較高的元素，用電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）分析低濃度的元素[8]。XRF 和ICP-MS 在主要性能上的優點和局限性見表1 所示[9]。

表1 XRF 和ICP-MS 在主要性能上的比較[9]

2 各國藥典中的XRF 標準

目前2015年版《中國藥典》暫未收載XRF 技術，但《美國藥典》（USP）41 版通則 〈735〉、歐洲藥典（EP）9.0 版通則2.2.37 和《英國藥典》BP 2019 版附錄ⅡK 均收載了XRF[10-12]。USP 介紹了XRF 的定義、原理、儀器性能、測定方法、確認和驗證等內容。EP 介紹了XRF 的定義、原理、測定方法、校正方法及計算公式。BP 介紹了XRF 的原理、儀器、基質效應和干擾、樣品制備、測定方法、儀器性能控制和驗證要求[12]。BP 還指出，XRF 作為質量控制或過程控制方法，廣泛用于篩選原料藥和制劑中的元素雜質。由于XRF 的非破壞性，適用于過程分析技術（PAT），如分析原料藥中殘留的痕量催化劑[12]。

3 XRF 在藥品元素雜質分析中的應用

3.1 在藥物研發中的應用

制藥企業通常將新藥研究重點聚焦于未滿足的醫療需求上，新藥的研發速度往往由患者驅動。因此，在藥物研發過程中快速做出決策，可更快地提高患者的治愈率，元素雜質分析是可提高研發效率的一個步驟。金屬催化劑通常用于原料藥的合成中，研發者需要監測各種原料和合成工藝中金屬催化劑的殘留情況，從而實施有效的控制策略。通常使用靈敏度、精密度高和選擇性好的電感耦合等離子體原子發射光譜法（ICP-AES 或ICP-OES）或ICP-MS，對藥物中的元素雜質進行分析[13-15]。然而，在藥物研發期間，許多樣品不需要這些昂貴、費時、靈敏度高的技術。研發者通常需要快速確定元素含量，以提高優化合成工藝的效率。XRF 可更快速、更簡便地測定原料、中間體和研發樣品中的元素雜質含量，同時保證必要的準確度。然而，傳統的XRF 分析需要大量樣品，不適用于藥物研發的早期階段。手持式XRF 具有幾個明顯的優點，可作為篩查金屬催化劑去除有效性的現場分析工具：一是成本遠低于傳統的實驗室儀器；二是可以在實驗室間移動使用；三是具有足夠的靈敏度；四是特別適用于專業能力不高的分析工作者。開發一種手持式XRF 儀器的方法通常需時不到30 分鐘，使用者可以在短時間內接受操作培訓[16]。Lewen N 等[16]使用手持式XRF 確立篩查金屬催化劑去除工藝的有效性，通過對不對稱Suzuki 偶聯反應、Buchwald-Hartwig 交叉偶聯反應中去除鈀以及Ullmann-Goldberg 偶聯反應中去除銅的研究，成功測定了近900 個固體和液體研發樣品中的鈀和銅含量。研究表明，手持式XRF 可替代傳統的ICP-OES 測定鈀和銅含量，快速確定金屬催化劑去除工藝的有效性，可為原子光譜和工藝化學部門節省近兩個月的全職人力工時（FTE），同時節省溶劑、氬氣和耗材的費用[16]。

3.2 在原料藥元素雜質分析中的應用

作為提高藥物安全性和有效性的一部分，制藥企業和監管機構對原料藥（API）的雜質控制十分重視。元素雜質可以從各種來源（如原料、試劑、溶劑、催化劑、反應容器、管道和其他用于合成藥物的設備）引入原料藥中。由于某些元素具有潛在的毒性，美國FDA“指南”指出，在制藥生產中控制殘留元素含量至關重 要[17]。Marguí E 等[18]利用WDXRF 測定原料藥中的金屬雜質鐵、鋅、鉻、鎳，方法的檢測限和定量限滿足歐洲藥品評價局（EMA）和ICH Q2（R1）的要求，適用于原料藥目標無機雜質的定性和定量檢測。與藥典的重金屬目視比色檢測方法不同，該技術可以輕松實現自動化，是快速常規分析的理想工具[18]。催化在醫藥化學工業中具有重要的作用，它可以減少碳-碳和碳雜原子鍵形成過程中的活化能，從而提高結構改造的效率，降低總成本和時間。鈀通常被認為是原料藥形成碳-碳和碳雜原子鍵應用最廣泛的金屬，在醫藥工業中廣泛用于催化反應[19，20]，但必須將其除去后方可成為藥用原料。Marguí E 等[20]通過高能偏振束能量色散X 射線熒光（HE-P-EDXRF），建立了一種簡單、快速、可靠的分析方法，可測定三唑類抗真菌原料藥中催化劑靶的殘留量。

EDXRF 類型中的TXRF，比傳統EDXRF 的背景信號更低且檢測限低3 個數量級[9]，還具有動態范圍寬（至少4 個數量級）、所需樣品量小（μg）、定量簡單、基質效應可忽略等優點，可通過內標實現對原子序數在14～92 內的多元素快速定量測定，是一種快速的元素篩選分析技術[8，21，22]。Wagner M 等[21]利用TXRF 研究了不同來源的胰島素、普魯卡因和色氨酸樣品中的微量元素的含量比例，得到了元素指紋圖譜相關信息，能夠區分不同生產純化工藝的不同批次的樣品。Lásztity A等[22]利用TXRF 篩查發現，左旋多巴中金屬含量低于5 μg·g-1，亞葉酸鈣中鐵、鋅、鍶的含量為44、10、6 μg·g-1，馬來酸依那普利中鐵的含量為17 μg·g-1。Antosz FJ 等[23]利用TXRF 對原料藥樣品中的鈀和銅進行了定量分析，測定結果在檢測限、定量限、準確度和精密度方面與ICP-MS 相當。

3.3 在藥用輔料元素雜質分析中的應用

2015 版《中國藥典》采用原子吸收光譜法（AAS）測定明膠空心膠囊中的有毒重金屬鉻的殘留，該法需要復雜的前處理過程，時間消耗較長。李俊卿、尹利輝等[24，25]建立了手持式EDXRF 快速檢測明膠空心膠囊中鉻的含量。方法的檢測限為10 mg·kg-1，與AAS 測試結果比較，Cr 含量大于10 mg·kg-1的陽性樣品的檢測率為100%。該方法可以無損傷直接測試樣品，一次同時分析多種元素，便于現場分析，分析時間短，4分鐘即可篩查出一個樣品，大大提高了分析效率。

3.4 在制劑元素雜質分析中的應用

對患者而言，藥物制劑的安全性和有效性更為重要。因此，重點研究XRF 在制劑元素雜質分析中的應用，比工藝研發時分析個別原料藥的元素雜質殘留量更有意義[26]。Goncalves LML 等[26]利用WDXRF 對兩種原研藥和仿制藥中的金屬元素雜質含量進行了測定，結果顯示，WDXRF 在一定范圍內具有可接受的線性、精密度和準確度，適用于藥物制劑中銅、鋅、鐵、鉻雜質的測定，是藥典中重金屬目視比色檢測法的良好替代方法。

由于制樣簡單、設備和分析成本較低，以及可現場對大量產品進行快速篩查，XRF 已被美國FDA 用于各種監管用途[9]。

圖1 美國FDA 現場作業中使用ICP-MS 和XRF 測定制劑中有毒元素的步驟[9]

圖1 描述了美國FDA 使用ICP-MS 方法與XRF 方法進行制劑元素分析時所涉及的各個步驟。圖左ICP-MS 方法的最大瓶頸是樣品制備過程，為得到適合分析的提取物，需要費時耗力的固體樣品消化和過濾步驟。相比而言，圖右中用于初篩的XRF 方法，僅需要簡單的樣品制備步驟（即直接按樣品原樣等份倒入XRF 分析杯中進行分析）。若初篩結果顯示特定元素未檢出，則可將樣品研磨為更均勻的粉末，以提供更準確的結果。通過手持式XRF 實現對樣品的高通量快速篩選，在遇到可能的違規樣本時，即當元素濃度超過限量及（或）處于急性或長期毒性水平時（如10 ppm），采用定量XRF 方法進行準確定量。若低于規定限值，利用ICP-MS 等實驗室技術進行定量分析獲得更準確的結果。此步驟節省了大量時間和成本，能夠在相同時間內篩選更多產品中是否存在有毒元素[9]。Arzhantsev S 等[27]使用連續波變換濾除光譜信號和噪聲成分的手持式XRF 光譜儀，篩查了27 種膠囊、片劑和膏劑藥物，發現14 種藥品含有重金屬，并利用電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）證實了XRF 的篩選結果，XRF 測定值的誤差在預期范圍內。

4 小 結

XRF 具有分析快捷、直觀、可靠等優勢，可作為AAS、ICP-AES 和ICP-MS 的替代技術，可定量分析原藥、輔料和制劑中的殘留元素。XRF 在藥物研發、原藥和制劑的金屬催化劑殘留及藥物有毒元素的快速篩查等方面的研究不斷深入，應用不斷擴大。除用于傳統的實驗室分析外，XRF 還是一種為數不多的可手持、便攜式的元素分析技術，很適合大批量樣品的快速、現場或在線檢測。此外，XRF 與化學計量學、色譜和光譜技術應用于過程控制，提供有毒元素的信息并篩查出成分復雜的假藥，這將是未來的發展方向。目前，USP、EP 和BP 均已收載XRF 作為法定的方法，在國際合作與交流日益加強的今天，建議將XRF 收載入《中國藥典》，建立相應的方法標準，有利于規范和指導XRF 在藥品質量控制中的應用，為藥品中元素雜質的檢測增加一種質量控制方法。