飼料中添加適宜水平鐵對建鯉肉質、魚糜穩定性及組織蛋白酶B/L的影響

李 冉，鐘海霞，李樹紅，楊 娟，胡 強，柯勤勤，白稚子，林 靈，李美良

（四川農業大學 食品學院，四川 雅安 625014）

鐵是生命體必須的微量元素，參與了機體許多重要的生理過程[1]。飼料中適宜的鐵水平，對于維持魚類正常生理代謝同樣是必不可少的。雖然魚類可通過其腸黏膜和鰓膜吸收可溶性鐵，但在自然狀態下，水中可溶性鐵的濃度較低，在商業化的精養體系中，飼料幾乎是魚類唯一的鐵源。飼料中鐵含量若未得到科學合理的控制，魚類極易出現缺鐵，進而造成飼料利用率下降，生長受阻，貧血等[2]。然而鐵過量也可引起魚類中毒，并抑制鋅等其他微量營養元素的吸收[3]，嚴重影響魚類生長發育，降低經濟效益。已有研究表明，飼料中添加適宜水平的鐵，可以促進羅非魚[2]、斑點叉尾鮰[4]、真鯛[5]等魚類的生長。

建鯉（Cyprlnus carpio varJian）是人工育成的水產品種，具有遺傳性狀穩定、生長快（比普通鯉魚生長快30%～40%）、體型優、肉質厚、肉味鮮等特點[6]。團隊在前期研究工作中，通過以含不同水平鐵的飼料飼喂幼建鯉，已經確定：當以血清鐵為標示時，其最適宜鐵需要量為147.4 mg/kg[7]，并且還發現該水平下，可提高建鯉幼魚的飼料利用效率，增強幼建鯉的消化吸收能力、免疫能力，以及腸道、肌肉抗氧化能力[8]。但飼料中鐵的水平對建鯉魚肉品質及魚糜品質的影響尚少見報道。

目前對于飼料中各營養素水平對魚類肉質影響的研究主要側重于肌肉組織學特性[9]、肌肉常規物理特性品質及化學營養成分的變化[10-11]等，研究尚不充分。而關于飼料營養素水平對魚肉風味品質和酶活特性影響的研究，特別對于魚類加工制品品質的研究很少。鐵對魚肉品質的影響的研究較少。ZHANG等[12]研究了飼料中鐵對生長中期草魚肉質的影響，結果表明鐵可提高草魚肌肉蛋白和脂肪含量，降低其水分和灰分含量，降低剪切力和羥脯氨酸含量，提高肌肉保水性，但對肌肉pH無顯著影響。

魚糜是將原料魚肉經過采肉、漂洗、精濾等步驟加工而成的肉糜狀產品，進一步經擂潰、成型等工序可加工成富有凝膠彈性的魚糜制品[13]。目前，我國魚糜產量達到了1.45×106噸，魚糜及其制品行業產值規模已經超過了200億元[14]，能夠顯著提高水產品的經濟附加值。以建鯉為原料開發魚糜及魚糜制品等精深加工前景看好。凝膠性能是評價魚糜制品的主要指標，而魚糜蛋白的穩定性直接決定了其凝膠性能。關于飼料中營養素鐵水平與魚糜品質的關系，尚少見進一步的研究報道。

組織蛋白酶 B（Cathepsin B，CAT B）及組織蛋白酶L（Cathepsin L，CAT L）是影響魚類肉質的重要蛋白酶，能夠破壞肌肉蛋白結構完整性，加速宰后魚肉片的軟化[15]。CAT B/L在漂洗后的魚糜[16]及魚糜的凍藏期間[17]仍殘留顯著的活性，進而在后續的魚糜制品加工過程中，可水解魚糜凝膠的關鍵結構蛋白——肌球蛋白，是導致魚糜制品質構品質劣變的主要原因之一[18]。另一方面，有研究表明，飼料中脂肪酸的種類與含量，可影響大西洋鮭魚體內CAT B的活性或其基因表達水平，同時其魚肉質構發生改變[19]。因此，研究建鯉魚肉中CAT B/L的活性或表達量，可為科學全面評估飼料中鐵水平對其肉質及魚糜品質的影響提供全面的評估信息。

本研究中以適宜鐵水平（146.1 mg/kg）飼料飼喂后的建鯉為對象，同時與鐵缺乏水平（53.9 mg/kg）下飼喂的建鯉進行魚肉品質、魚糜品質、CAT B/L活性及表達的比較。結果從肉質、產品品質角度，更全面地評價該鐵水平（147.4 mg/kg）對建鯉的適宜性，以期能夠為深入探討“鐵調控與鯉科魚肉品質變化關系，進而獲得更優質水產食品加工原料”提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物性實驗材料 建鯉及采樣：以鐵水平為146.1 mg/kg（適宜組）及 53.9 mg/kg（缺乏組）的半純合飼料飼喂90 d的建鯉幼魚 [初始體質量分別為（11.34±0.94） g及（11.37±0.91） g，采樣時體質量分別為（148.10±24.69） g 及（222.32±34.52） g]，由四川農業大學動物營養所水生動物飼料與營養實驗室飼養并提供。其飼料配方組成、飼料鐵含量測定及飼養過程參見LING等[7]的方法。飼養時每個處理組3個重復，每個重復50尾，即每個處理組150尾。飼養結束后，每組隨機采樣30尾魚。用3%的烏來糖麻醉后處死，去皮，在背鰭第一硬棘下方、脊椎骨上方部位取背肌樣品，用于指標測定，每個指標5尾魚，取樣過程在4℃下完成。

1.1.2 建鯉CAT B/L多克隆抗體及背肌組織切片由四川農業大學食品學院水產品加工與理論實驗室制備保存，其制備過程參見陳秀華[20]的方法。其中CAT B多克隆抗體效價為1∶256000，CAT L多克隆抗體效價為 1∶512000。

1.2 方法

1.2.1 建鯉魚肉品質指標測定 參考任澤林等[21]的實驗方法進行肌原纖維耐折力（myofibril breakresisting force，MBF）的測定，取背肌樣品（5.0±0.5） g，加 100 mL A 液（KC1 14.9 g、EDTA-2Na 3.44 g和硼酸4.78 g，定容至2 L，用四硼酸鈉調解pH=7.0），[2 r/min勻漿15 s，取樣于10×40倍顯微鏡下測量肌原纖維長度，每個樣隨機記錄50個觀測數據，重復10次。計算公式如式（1）：

式（1）中，Li為每次測定肌原纖維長度（cm）；A為顯微鏡放大倍數，為400；B為為擴印倍數，為3.7；n為測定次數。

肌原纖維斷裂指數（myofibril fragmentation index，MFI）測定，參考 Hopkins等[22]方法，稍有改動。取背肌樣品5.0 g，加30 mL緩沖液（100 mmol/L KCl，20 mmol/L K2HPO4，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L MgCl2，1 mmol/L疊氮鈉），均質機均質 15 s后，用 4層紗布過濾，10 mL緩沖液沖洗濾渣，收集濾液在2 ℃下離心（1000g，10 min），沉淀用 10 mL 緩沖液懸浮，再次離心，重復2次。最后將沉淀用10 mL緩沖液懸浮，稀釋20倍后，測定540 nm處吸光值。每尾魚3次重復，取平均值后乘以200即為MFI。

剪切力用公斤力值（kg·f）表示，測定方法參考李池陶等[23]的方法，將背肌樣品置于冰上沿體測線方向，用鋒利的刀片切取長×寬為6 cm×2 cm，厚度（1 cm）一致的肉樣，每尾魚取1個肉樣，每個肉樣剪切3次。將所得15次測定值取其平均數。評定標準為剪切力值越小硬度越小。

pH 測定：每尾魚取背部肌肉（5±0.5）g，剪碎，加蒸餾水50 mL，勻漿管勻漿，用酸度計測量其勻漿液pH值。3次重復，取平均值。

肌肉失水率的測定參考任澤林等[21]的方法。每尾魚取（5±0.5） g 背肌，記錄數據為W0，置于沸水中煮沸2.5 min后，冷卻，用濾紙吸干魚肉表面水分，再次稱質量記錄為Wt。取失水率的平均值。計算公式如式（2）：

膠原蛋白質量濃度測定參考任澤林等[21]的方法。稱取1 g肉樣置于勻漿管中，加10倍體積的蒸餾水，充分勻漿2 min，移至離心管中，在10000 r/min轉速下離心20 min，棄去上清液。再加入20倍體積的0.1 mol/L NaOH溶液，磁力攪拌器攪拌過夜，在 10000 r/min轉速下離心20 min，棄去上清液，如此重復2次。之后加入 l0倍體積的0.5 mol/L冰醋酸，磁力攪拌器攪拌過夜，于10000 r/min轉速下離心20 min，重復1次，將上述上清液合并作為可溶性膠原蛋白提取液。沉淀中加入5倍體積蒸餾水放入高壓滅菌鍋內，在120℃條件下加熱1 h，然后在10000 r/min轉速下離心20 min，上清液作為不溶性膠原蛋白提取液。分離的可溶性和不可溶性膠原蛋白，分別采用Bradford法測定其蛋白質質量濃度。

1.2.2 建鯉肌肉中CAT B/L酶活性及蛋白表達量測定 建鯉肌肉CAT B/L粗提液制備過程參考李樹紅[24]的方法。CAT B/L活性測定基本參照BARRETT等[25]的方法。分別以熒光合成肽Z-Arg-Arg-AMC和Z-Phe-Arg-AMC為底物，采用熒光酶標儀測定。激發波長380 nm，發射波長460 nm。一個酶活單位定義為在反應條件下，能夠在1 min內水解底物并釋放出1 nmol AMC產物的酶活性量（1 nmol/min）。

采用免疫組織化學法對兩個處理組建鯉背肌中的CAT B/L進行蛋白水平定量，具體操作參考李松等[26]的方法。

1.2.3 建鯉魚糜穩定性相關品質指標測定 建鯉魚糜的制備參考陳秀華等[27]的方法。建鯉用10℃以下自來水清洗，去除內臟，再次清洗，在4℃下進行魚糜的制備。具體操作如下，采肉：去皮、去除紅肉，取背部的白肉，充分絞碎至3～6 mm3；漂洗：將魚肉糜與5倍體積的4℃去離子水混合，緩慢攪拌10min，使水溶性蛋白等成分充分溶出，靜置8～10 min使魚肉充分沉淀，傾去漂洗液，再用冷卻水先后漂洗兩次，最后一次用0.15%食鹽水漂洗；離心脫水：7000 r/min，4℃離心 15 min。

魚糜肌動球蛋白的提取參考BENJAKUL[28]的方法。

肌動球蛋白穩定性測定參考JERVIS等[29-30]的方法，測定肌動球蛋白的Ca2+-ATPase活性（Ca2+-ATPase activity，CA）、蛋 白 表 面 疏 水 性（protein surface hydrophobicity，PSH）、總巰基質量摩爾濃度（total sulfhydryl content，TSH）、二硫鍵質量摩爾濃度（disulfide bonds content，DB），各指標均重復測定3次。一個CA活力單位定義為25℃下每毫克蛋白質在1 min內水解底物并產生的無機磷的量（μmol·min-1·mg-1）。PSH指數為測得的熒光強度對蛋白質質量濃度繪制線性回歸曲線的最初的曲線斜率值。

TSH含量按以下公式計算：

式（3）（4）中：A412為 412 nm 波長處的吸光度；n為稀釋倍數；ε 為量吸光系數 13600/（L·mol-1·cm-1）；ρ為蛋白質（mg/mL）。

DB含量按以下公式計算：

二硫鍵質量摩爾濃度/（μmol/g）=

式（4）（5）中，A412為 412 nm 波長處的吸光度；n為稀釋倍數；ε 為量吸光系數 13900/（L·mol-1·cm-1）；ρ為蛋白質（mg/mL）。

硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）值測定參考陳慧斌等[31]的方法，采用硫代巴比妥酸法測定魚糜中脂肪氧化產生丙二醛量，重復3次。計算公式為：

式（7）中，A為532 nm波長處與600 nm波長吸光值的差值；W為肉樣質量。

1.3 數據處理及統計分析

采用SPSS 22.0統計軟件，計算各指標的平均值和標準差，采用單因素方差分析進行差異顯著性分析。免疫組化光密度采用IPP 6.0軟件進行分析。

2 結果與討論

2.1 飼料中添加適宜水平鐵對建鯉魚肉品質的影響

飼料中適宜水平鐵對建鯉肌纖維物理特性相關品質指標MBF及MFI、剪切力、膠原蛋白質量濃度的影響見表1。與缺乏組相比，適宜組的MBF有所提升，MFI值降低，但差異均不顯著（P＞0.05），適宜組的剪切力、可溶膠原蛋白質量濃度、不溶膠原蛋白質量濃度和總膠原蛋白質量濃度均極顯著上升（P＜0.01），分別增加 31.80%、305.45%、180.98%、219.35%。

表1 飼料中適宜水平鐵對建鯉肌纖維物理特性的影響（±s）Table1 Effect of suitable dietary iron supplement on muscle fiber property（±s）

表1 飼料中適宜水平鐵對建鯉肌纖維物理特性的影響（±s）Table1 Effect of suitable dietary iron supplement on muscle fiber property（±s）

注：同列數據肩標* 表示差異顯著（0.01＜P＜0.05），** 表示差異極顯著（P＜0.01）。

組別M B F/μ m M F I/A 540剪切力/(k g·f)可溶膠原蛋白質量濃度/(m g/m L)不溶膠原蛋白質量濃度/(m g/m L)總膠原蛋白質量濃度/(m g/m L)適宜組0.10 06±0.01 27 56.54±4.40 0.12 60±0.00 68**0.23 80±0.03 85**0.60 90±0.15 36**缺乏組0.37 09±0.11 83**0.09 96±0.09 78 57.48±4.12 0.09 56±0.01 41 0.05 87±0.01 32 0.13 20±0.03 96 0.19 07±0.04 52

嫩度/硬度是肉類食用品質的一個重要感官特征，兩者是從同一問題的兩個不同側面對肉質構特征的描述。魚肉與畜禽肉不同，其本身質地非常柔軟，且魚死后的自溶速度明顯快于畜禽動物，因此魚肉片不需要嫩化，保持其硬度品質才能保證商品價值，也更符合消費者的需求。肌纖維的物理特性——MBF和MFI值能夠間接反應肌肉的硬度品質，而剪切力直接反應了肉質的硬度值，其值越高，硬度越強。研究表明MBF與肌肉組織的剪切力值成正比[32]，MFI值與剪切力值成反比[33]。本研究中，經添加適宜水平鐵的飼料飼喂后，建鯉肌肉MBF提高，MFI值降低，剪切力顯著增加，說明肉質硬度提高。因此，飼料中適宜水平鐵改善了建鯉魚肉的硬度品質。

此外，膠原蛋白是一種重要的肌肉組織成分，肌原纖維被膜結締組織中含有大量的膠原蛋白，在肌肉表面形成類似鞘膜結構的連續分布的致密原纖維網，在很大程度上決定著肌肉的持水性能和硬度；膠原蛋白含量越高，肌原纖維被膜韌性越強，從而肌原纖維耐折力越強[21]。SATO等[34]研究表明，鯉魚肌肉總膠原蛋白含量越高，肌原纖維耐折力和肌肉硬度越高，本研究結果與此相似。

適宜水平鐵對建鯉魚肉pH值、失水率的影響見表2。相對于缺乏組，適宜組肌肉的失水率呈下降趨勢，但差異不顯著（P＞0.05）。此外，2組肌肉 pH 值相似，適宜組略低，差異不顯著（P＞0.05）。失水率可反映肌肉系水力強弱，是肌原纖維之間及與肌質之間致密性的一個間接指標，對肉質變化具有很大影響[35]。前期研究表明，飼料中適宜水平的鐵極顯著提高了建鯉幼魚體蛋白沉積率[8]，可能是適宜組建鯉的失水率從24.47%降低到22.77%的原因之一。建鯉魚肉的系水能力提高，對改善魚肉多汁性品質有一定的促進作用。另一方面，pH值下降可引起肌肉細胞膜受損[36]，從而改變肉的保水性、嫩度、組織狀態和顏色等，直接影響肉品的保藏性、蒸煮損失、加工能力等。而本研究中適宜水平營養素鐵對肌肉pH無顯著影響，不會引起宰后魚肉品質的生化劣變。

2.2 飼料中添加適宜水平鐵對建鯉肌肉中CAT B/L活性及蛋白表達量的影響

飼料中適宜水平鐵對建鯉肌肉組織中CAT B/L活性的影響如圖1。適宜組的建鯉肌肉中CAT B活性、CAT L 活性分別極顯著（P＜0.01）及顯著（0.01＜P＜0.05）低于缺乏組。

表2 飼料中適宜水平鐵對建鯉肌肉pH值和失水率的影響（±s）Table2 Effect of suitable dietary iron supplement on muscle pH and rate of water loss（±s）

表2 飼料中適宜水平鐵對建鯉肌肉pH值和失水率的影響（±s）Table2 Effect of suitable dietary iron supplement on muscle pH and rate of water loss（±s）

組別p H適宜組6.50±0.04缺乏組6.65±0.05失水率/%22.77±1.19 24.47±1.59

圖1 2組建鯉背肌中的CAT B/L活性比較Fig.1 CAT B/L activities in dorsal muscle of Jian carp in each group

進一步采用免疫組織化學的方法，利用團隊前期制備的CAT B/L多克隆抗體，對兩組建鯉肌肉中CAT B/L進行定位及相對定量。由圖2可知，經抗體標記、DAB顯色后的2組建鯉肌肉，均呈現不同程度的陽性染色，棕色染色部位即為真核表達的CAT B/L。采用IPP 6.0軟件進行光密度數據分析，以進行相對定量，結果見圖3，適宜組的建鯉肌肉中CAT B/L蛋白表達量均極顯著低于缺乏組（P＜0.01）。

CAT B、CAT L可水解肌原纖維蛋白[15]，且內源CAT B、CAT L是引起其魚糜凝膠軟化的關鍵性蛋白酶[18]。CAT B和CAT L活性更高的魚，不僅死后魚肉蛋白的降解速度加快，而且高酶活亦影響魚肉片的硬度品質，同時還可能進一步影響加工制品如魚糜制品的質構品質。本研究中，飼喂適宜水平鐵的建鯉肌肉中CAT B/L活性及蛋白表達量均降低，推測鐵很可能通過某種途徑調控了CAT B/L的活性及蛋白表達，其具體機制有待深入研究。同時結合適宜組魚肉剪切力值提高，說明適宜水平鐵明顯改善了魚肉的硬度品質。因此，通過營養調控進而調節魚肌肉組織中Cathepsins的活性和表達量，對從飼養源頭控制魚肉及加工制品品質，具有重要的研究意義。

圖2 2組建鯉背肌中CAT B/L蛋白表達量的免疫組化測定Fig.2 Immunohistochemisty of CAT B/L expressions in dorsal muscle of Jian carp in each group

圖3 2組建鯉背肌中CAT B/L蛋白表達量比較Fig.3 CAT B/L expression levels in dorsal muscle of Jian carp in each group

2.3 飼料中適宜水平鐵對建鯉魚糜穩定性的影響

對2種營養素鐵水平飼喂后的建鯉背肌進行采肉、加工魚糜，測定魚糜肌動球蛋白穩定性及魚糜脂肪氧化程度，分析魚糜穩定性相關指標差異情況，結果如表3所示。

表3 飼料中適宜水平鐵對建鯉魚糜穩定性相關指標的影響（±s）Table3 Effect of suitable dietary iron supplement on the stability of Jian carp surimi（±s）

表3 飼料中適宜水平鐵對建鯉魚糜穩定性相關指標的影響（±s）Table3 Effect of suitable dietary iron supplement on the stability of Jian carp surimi（±s）

*：P＜0.05，**：P＜0.01，與缺乏組比較。

組別T B A/(m g/k g)C A/(μ m o l·m i n-1·m g-1)T S H/(μ m o l/g)D B/(μ m o l/g)P S H/(S o A N S)缺乏組適宜組0.16 29±0.00 11**13 0.10±3.94 57**16 9.12±0.30 88**53.05±1.61 88*0.21 85±0.01 39**58.41±1.51 07 10 4.98±0.76 55 0.12 58±0.00 05 28 4.63±2.44 66 0.35 11±0.00 80

與缺乏組相比，適宜組魚糜肌球蛋白CA活性、TSH質量摩爾濃度分別極顯著（P＜0.01）上升了29.49%、61.10%，同時適宜組DB質量摩爾濃度和PSH 則分別顯著（0.01＜P＜0.05）及極顯著（P＜0.01）下降了9.17%、54.29%。說明以適宜水平營養素鐵飼喂的建鯉加工魚糜，其肌動球蛋白的CA活性損失、巰基氧化損失及蛋白構象改變的程度更小，穩定性明顯優于缺乏組。此外，在脂肪氧化相關指標方面，適宜組魚糜TBA值極顯著（P＜0.01）低于缺乏組，說明經適宜水平鐵飼料飼喂的建鯉加工魚糜，其TBA值可發生明顯降低（37.77%），脂質氧化程度更小，穩定性更佳。

在魚糜蛋白中，肌動球蛋白是形成魚糜制品凝膠網狀結構的重要蛋白，在魚糜加工過程中易發生變性，導致其物理、化學特性發生改變，從而使魚糜制品質量、穩定性下降[37]。此外，肌原纖維蛋白易于氧化，使其功能性質受到很大的損失[38]，也可降低魚糜制品的品質。因此，通常將肌動球蛋白的氧化、變性程度作為判斷魚糜性能好壞的指標。而究其根本，魚糜及其制品品質與原料魚肉品質之間，也存在很大程度的相關性。目前從營養素水平分析探討其對魚肉品質及魚糜穩定性的影響較少。

CA、PSH、TSH、DB等4個指標從酶活、巰基氧化、蛋白構象等角度，反應了肌動球蛋白的穩定性。本研究中，2組原料魚肉經相同工藝加工成魚糜，但營養素鐵水平適宜組的建鯉魚糜初始CA活性、TSH質量摩爾濃度極顯著高于缺乏組，而DB質量摩爾濃度和PSH則分別明顯低于缺乏組，說明飼料中添加適宜水平的鐵，更利于維持魚糜蛋白的穩定性，進而可能會促進魚糜制品的質構品質。同時，前期研究結果已表明，鐵在建鯉機體抗氧化方面具有一定的促進作用，飼料中添加適宜水平的鐵，可增強建鯉抗氧化酶系統及非酶抗氧化系統的防御能力[7]。因此推測，可能是由于適宜組原料魚肉蛋白本身的氧化還原穩定性更高，使其對在魚糜加工工序中發生的氧化，抵抗能力更強。正如ZHANG等[12]研究發現飼料中營養素鐵能極顯著降低草魚肌肉中的蛋白羰基（PC）含量，增強機體和組織中主要的抗氧化能力。

TBA值是測定脂肪氧化的主要指標之一。本研究表明，飼料中添加適宜水平鐵飼喂的建鯉，其魚糜脂肪氧化程度更低。該結果與凌娟[8]的前期研究結果一致，即鐵能夠極顯著地降低建鯉肌肉組織中丙二醛（MDA）含量。ARMENTEROS等[39]的研究證實脂質氧化和蛋白氧化之間呈正相關。脂肪氧化次級產物可引發肌原纖維蛋白或肌動球蛋白的氧化，進而導致結構和功能改變[40]。因此推測，由于適宜組建鯉魚糜TBA值較低，其魚糜蛋白的氧化速度會相應減弱，更有利魚糜加工制品的穩定性。

3 結語

相對于缺乏組（53.9 mg/kg），建鯉飼料中添加正常水平營養素鐵（146.1 mg/kg），可在一定程度上提升建鯉宰后魚肉片的硬度及膠原蛋白含量，降低肌肉中與自溶相關的CAT B/L活性及蛋白表達量，對于避免宰后魚肉片在貯藏及加工過程中的軟化具有正面效果；正常水平營養素鐵可有效保持建鯉魚糜肌球蛋白的穩定性，有利于魚糜及魚糜制品的加工品質。