蛹蟲草培養基多糖的提取及抗腫瘤活性研究

孫 葉 ，包建忠 ，劉 紅 ，馬 輝 ，張 甜 ，陳秀蘭 *

（1.江蘇里下河地區農業科學研究所 ，江蘇 揚州225007；2.揚州大學 動物科學技術學院，江蘇 揚州 225009；3.揚州循天嶺生物科技有限公司，江蘇 揚州 225007）

蛹蟲草（Cordyceps militarisL Link），俗稱北冬蟲夏草，是蟲草屬的模式種。蛹蟲草子實體采收后的培養基富含菌絲體和子實體殘留以及其他代謝物質[1]，可作為原料直接用于釀造食品[2]、飼料[3-4]、肥料等開發；二次發酵可生產殺蟲真菌制劑等產品；蛹蟲草培養基的綜合利用能變廢為寶，為企業增加效益。目前蛹蟲草培養基活性物質的提取分離[5－8]是研究的熱點，蛹蟲草大米培養基多糖提取方法有浸提法、熱回流水提法、超聲波提取、微波提取等，在此基礎上，還發展了酶提等方法[9-12]。目前小麥培養基的生產規模在不斷擴大，但小麥培養基多糖提取與開發的研究相對較少。

藥用真菌多糖的抗腫瘤活性已被廣泛認可[13-14]，蛹蟲草子實體或菌絲體提取物具有調節免疫系統，抗腫瘤，抗衰老，抗感染，降血糖、血脂，治療艾滋病等作用[14-19]，蛹蟲草培養基多糖是否也有這些功效還有待研究。肝癌是現代社會惡性程度和發病率較高的惡性腫瘤，針對肝癌的藥物、保健品開發十分重要。有研究證明蛹蟲草水提物可通過線粒體途徑抑制HepG2肝癌細胞和 MCF-7人乳腺癌細胞的生長[20]，高純度蟲草素有直接抗HepG2肝癌細胞的作用[21-22]，蛹蟲草的其他活性物質對HepG2肝癌細胞是否也有相同作用值得研究探討。MTT法被公認為是抗腫瘤藥物大規模粗篩的有效方法，用MTT法研究蛹蟲草多糖抗腫瘤效果已有一定進展[23-25]。本實驗首次以蛹蟲草小麥培養機為原料，通過熱回流水提法正交試驗確定多糖的最佳提取工藝，并利用MTT法研究不同提純處理的培養基多糖對肝癌細胞的抑制作用，并與蛹蟲草子實體多糖進行比較，研究結果對蛹蟲草小麥培養基多糖的開發利用有一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 蛹蟲草培養基由揚州循天嶺生物科技有限公司提供。試驗用細胞株：HepG2肝癌細胞（上海中科院）。

無水乙醇、氯仿、正丁醇等均為國藥分析純，胎牛血清、DMEM高糖細胞培養基及0.05%胰酶細胞消化液購自Gibco公司，青霉素鏈霉素混合液及四甲基偶氮唑藍（MTT）購自Sigma公司，順鉑凍干粉每支10 mg購自上海源葉生物技術有限公司，二甲基亞砜（DMSO）購自AMRESCO公司。

1.1.2 設備 TGL-16M低溫高速離心機，上海滬湘儀公司產品；RE-201D旋轉蒸發器，鄭州特爾儀器設備有限公司產品；CU600型電熱恒溫水箱，上海越平科學儀器有限公司產品；電熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科技有限公司產品；BS124S電子天平，賽多利斯科學儀器北京有限公司產品；SOW-25DI冷凍高速微粉機，山東三清不銹鋼設備有限公司產品；Ps-250萬能破碎機，南京威利朗食品機械有限公司產品；RY-NSG-20LC超聲波提取濃縮機，海銳元機械設備有限公司產品；Thermo Multiskan Go全波長酶標儀，賽默飛世爾科技公司產品；Telstar Lyoquest-55凍干機，西班牙泰事達公司產品；LKTC-B1-T水浴恒溫振蕩器，常州國華電器有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 小麥培養基的獲得 小麥、蠶蛹粉和營養液（葡萄糖15 g，蛋白胨10 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂1 g，VB1 1 mg，加水定容至法/三級 mL，pH值自然），按質量比（25∶2∶50）加入玻璃瓶中，封口，高溫高壓121℃滅菌60 min，放涼備用。培養基無菌環境下接蛹蟲草菌種B6，培養子實體，子實體采收后，培養基烘干至含水質量分數小于10%后，密封保存備用。

1.2.2 水熱回流提取法提取蛹蟲草粗多糖 取2 g一定目數蛹蟲草培養基粉末，用蒸餾水熱回流重復提取數次，合并濾液，用旋轉蒸發儀進行減壓濃縮至1 g∶10 mL，冷卻后加入3倍量乙醇使其沉淀，離心后傾出上清液，沉淀加少量水溶解，加入2倍量乙醇使其沉淀，將最后沉淀物用蒸餾水溶解，并定容于50 mL容量瓶中，用苯酚硫酸法[26]測定蛹蟲草多糖含量。單因素試驗設計：①培養基物料大小的影響。固定提取溫度為80℃，提取時間120 min，提取2次，料液比（1 g∶20 mL），物料大小設定為 20、40、60、80、100、200目，6個水平。②料液比影響。固定培養基目數為60目，提取溫度為80℃，提取時間120 min，提取 2 次，料液比（g/mL）設定為 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，4個水平。③提取溫度的影響。固定培養基目數為60目，提取時間120 min，提取2次，料液比設定為 1 g∶20 mL， 提取溫度設為 60、80、100 ℃，3 個水平。④提取時間的影響。固定培養基目數為60目，提取溫度為80℃，提取2次，料液比設定為1 g∶20 mL， 提取時間設定為 60、120、180 min，3 個水平。⑤提取次數的影響。固定培養基目數為60目，浸提溫度為80℃，提取時間為120 min，料液比設定為 1 g∶20 mL，設定提取次數為 1、2、3 次，3 個水平。每水平3次重復。

1.2.3 超聲波水提法提取蛹蟲草粗多糖 取2 g蛹蟲草二茬培養基粉末，室溫20℃，用倍量體積蒸餾水于超聲提取器中超聲提取數次，合并濾液，用旋轉蒸發儀進行減壓濃縮至1∶10（g/mL），冷卻后加入3倍量乙醇使其沉淀，離心后傾出上清液，沉淀加少量水溶解，加入2倍量乙醇使其沉淀，將最后沉淀物用蒸餾水溶解，并定容于50 mL容量瓶中，用苯酚硫酸法測定蛹蟲草多糖含量。單因素試驗設計：①料液比影響。固定培養基目數為60目，超聲波時間為 60 min，浸提 2次，料液比（g/mL）設定為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，4 個水平。②超聲波時間的影響。固定培養基目數為60目，超聲波提取2次，料液比設定為 1 g∶20 mL，超聲波時間為 30、60、90 min，3個水平。③提取次數的影響。固定培養基目數為60目，超聲波時間為60 min，料液比設定為1 g∶20 mL，設定提取次數為 1、2、3 次，3 個水平。每水平3次重復。

1.2.4 不同乙醇體積分數對粗多糖得率的影響利用熱回流水提法單因素試驗獲得的最佳工藝提取粗多糖濃縮液，設定醇沉體積分數為50%、60%、70%、80%、90%，5個水平3次重復，沉淀過夜，4000 r/min常溫離心，傾出上清液，冷凍干燥，獲得粗多糖質量，計算粗多糖得率。

1.2.5 熱回流水提法提取蛹蟲草培養基粗多糖正交試驗設計 在單因素試驗的基礎上，利用L9（34）正交試驗設計方案優化水熱回流提取法提取蛹蟲草二茬草培養基多糖最佳工藝參數，因素水平設計見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table1 Factors and levels in orthogonal design

1.2.6 蛹蟲草培養基去脂去蛋白質多糖A和去脂粗多糖B、水提醇沉粗多糖C的獲得 稱量60目的蛹蟲草培養基5 g，3次重復，1 g∶10 mL乙醇去脂處理，離心去乙醇后40℃烘干，料液比1 g∶25 mL，100℃熱回流提取3次、提取時間90 min、體積分數80%乙醇、醇沉，離心傾出上清液，沉淀溶于少量蒸餾水，加2倍體積乙醇，醇沉離心，重復1次，沉淀用無水乙醇、丙酮、乙醚各清洗1次，獲得沉淀一半冷凍干燥獲得去脂粗多糖B；一半溶于少量蒸餾水，saverage（氯仿∶正丁醇=4∶1，體積比）去蛋白質 5 次，加3倍無水乙醇，離心，沉淀冷凍干燥，獲得去脂去蛋白質多糖A。

稱量60目培養基5 g，3次重復，料液比1 g∶25 mL，100℃熱回流提取3次、提取時間90 min、體積分數80%乙醇、醇沉，離心傾出上清液，沉淀溶于少量蒸餾水，加2倍體積乙醇，醇沉離心，重復1次，沉淀用無水乙醇、丙酮、乙醚各清洗1次，沉淀干燥獲得水提醇沉粗多糖C。

1.2.7 蛹蟲草子實體不同處理獲得提純多糖 稱量蛹蟲草B6菌種培養的100目子實體粉5 g，3次重復，質量比1∶10乙醇去脂去脂處理，離心去乙醇后 40 ℃烘干，料液比 1 g∶25 mL，60、80、100 ℃熱回流提取3次、提取時間90 min、體積分數80%乙醇、醇沉，離心傾出上清液，沉淀溶于少量蒸餾水，加2倍體積乙醇，醇沉離心，重復1次，沉淀用無水乙醇、丙酮、乙醚各清洗 1 次，saverage（氯仿∶正丁醇=4∶1，體積比）去蛋白質5次，加3倍無水乙醇，離心，沉淀用無水乙醇、丙酮、乙醚各清洗1次，沉淀冷凍干燥獲得去脂去蛋白質多糖D、E、F。

采用菌種B6培養的100目蛹蟲草子實體粉5 g，3次重復，料液比1 g∶25 mL，80℃熱回流提取3次、提取時間90 min、體積分數80%乙醇醇沉，離心傾出上清液，沉淀溶于少量蒸餾水，加2倍體積乙醇，醇沉離心，重復1次，沉淀用無水乙醇、丙酮、乙醚各清洗1次，沉淀干燥獲得子實體水提醇沉粗多糖G。

1.2.8 MTT比色法測定提取多糖抗腫瘤活性 配置加體積分數10%牛血清的DMEM培養基，培養肝癌Hepg2細胞至對數生長期，用體積分數0.05%胰酶消化，加含體積分數10%牛血清的DMEM培養液吹打成細胞懸液，調整細胞濃度至1.0×104每孔后，接種于96孔板中，每孔接種200 μL細胞懸液，37℃，體積分數5%CO2培養箱中孵育24 h后，棄培養液，給藥組分別加入200 μL質量濃度分別為0.25、0.5、1、2.5、5 mg/mL 的藥物 A、B、C、D、E、F、G， 對照組則加入等體積的完全培養基，陽性對照加質量濃度為20 μg/mL順伯，每組設6個復孔，置于37℃、5%CO2條件下培養 24、48、72 h。每孔加入 10 μL濃度為5 mg/mL MTT試劑培養4 h。小心棄去上清液，每孔加入 100 μL DMSO，振蕩 10 min，再用酶標儀測定OD492，由測得的吸光度計算抑制率。

式（1）中，I為抑制率；OD0為對照組 OD 值；OD1為給藥組OD值。

1.2.9 數據處理 試驗數據用統計學方法進行處理，單因素、二因素方差分析、正交試驗結果的極差分析、方差分析、圖表制圖采用SPSS 19.0、Excel軟件制作分析。

2 結果與分析

2.1 粗多糖提取單因素試驗

2.1.1 物料顆粒大小、提取溫度對熱回流水提法提取粗多糖含量的影響 由表2可知，采用熱回流水提法提取蛹蟲草培養基粗多糖，物料大小從20～60目，粗多糖質量分數增加明顯，差異顯著；60～100目后粗多糖含量趨于平穩，無顯著差異，200目粗多糖質量分數明顯降低。

粗多糖質量分數隨著提取溫度提高而增加，提取溫度80℃時粗多糖質量分數較提取溫度60℃時有明顯提高且差異顯著，但較提取溫度100℃時粗多糖質量分數無顯著差異。

表2 物料大小、提取溫度對粗多糖質量分數影響Table2 Effect of diameter of materials and extraction temperature on the content of coarse polysaccharide

2.1.2 時間對熱回流水提法和超聲波水提法提取粗多糖含量的影響 由表3可知，物料大小60目、提取溫度為80℃、提取2次、料液比1 g∶20 mL、熱回流提取法的提取時間為120 min時粗多糖得率最高，較提取時間為60 min和180 min，有顯著差異。

物料大小60目、提取2次時、料液比1 g∶20 mL，室溫超聲波水提法提取時間30 min粗多糖質量分數較高，與提取時間60 min處理有顯著差異，與提取時間90 min處理無顯著差異。在料液比、物料大小、提取時間同為60 min時，熱回流水提法提取粗多糖質量分數明顯高于超聲波水提法。

表3 提取時間對粗多糖質量分數影響Table3 Effect of extraction time on the content of coarse polysaccharide

2.1.3 料液比對熱回流水提和超聲波水提粗多糖質量分數的影響 由表4可知，熱回流水提法，提取時間為120 min、物料大小60目、提取溫度為80℃、提取2次，料液比為1 g∶20 mL時粗多糖質量分數最高，較料液比1 g∶10 mL 和 1 g∶15 mL 有顯著差異；與料液比為1 g∶25 mL時粗多糖質量分數無顯著差異。

超聲波水提法，提取時間30 min、物料大小60目、室溫提取2次，料液比為1 g∶25 mL時粗多糖質量分數最高，較其他處理差異顯著。

表4 料液比對粗多糖質量分數影響Table4 Effect of ratio of materialto solvent raw（w/v） on the content of coarse polysaccharide

2.1.4 熱回流水提和超聲波水提提取次數對粗多糖質量分數的影響 由表5可知，在料液比1 g∶20 mL、物料大小60目，提取溫度為80℃、提取時間120 min，熱回流提取3次時粗多糖質量分數較高，較提取2次處理無顯著差異，與提取1次處理有顯著差異。

在料液比1 g∶20 mL、物料大小60目、提取時間30 min時，室溫超聲波提取3次時粗多糖質量分數最高，較提取1次和提取2次粗多糖質量分數有顯著差異。

表5 提取次數對粗多糖質量分數影響Table5 Effect of extraction number on the content of coarse polysaccharide

2.1.5 乙醇濃度對熱回流水提培養基粗多糖得率的影響 由表6可知，熱回流法提取蛹蟲草培養基多糖，醇沉濃度越高，粗多糖得率越高，醇沉體積分數60%～70%時，粗多糖得率無顯著差異，醇沉體積分數90%時，粗多糖得率最高，達25.146%，與其他處理有顯著差異。

表6 醇沉濃度對粗多糖得率的影響Table6 Effect of extraction number on the content of coarse polysaccharide

2.2 正交試驗優化提取工藝

由方差分析可知，影響提取多糖含量的因素中提取溫度、提取次數、提取時間、料液比對提取蛹蟲草二茬草培養基粗多糖的提取率具有顯著的影響，4個因素的主次關系是：提取溫度＞提取時間＞提取次數＞料液比。通過鄧肯多重比較和邊際均值的直觀圖和經濟成本的考慮，確定提取蛹蟲草培養基粗多糖的最佳工藝為A3B2C1D3，即提取溫度為100℃、提取3次、提取90 min、料液比1 g∶25 mL。該工藝為正交試驗8號處理，多糖質量分數平均值為34.724 g/hg，為正交試驗所有處理中最高，提取工藝優良得到了驗證（表 7、8，圖 1）。2015 年王雪等[10]利用超聲波—酶法所得蛹蟲草大米基質多糖的得率為30.27%，數據偏高是因為小麥培養基多糖組成復雜，既有菌絲體多糖、子實體多糖、小麥淀粉，也有蟲草生長過程中轉化的產生的多糖。已有除淀粉的相關研究[5]，本研究認為培養基淀粉具有一定的營養價值，除淀粉工藝需要從產品安全性、營養價值和開發成本綜合考慮。

表7 正交表L9（34）及實驗結果Table7 Orthogonal table and experimental results

表8 正交試驗結果方差分析Table8 Analysis of variance of orthogonal experiment

圖1 不同處理的粗多糖質量分數的估算邊際均值Fig.1 Mean estimate the marginal average about content of coarse Polysaccharide of different treatments

2.3 蛹蟲草培養基提取多糖和子實體多糖對Hepg2腫瘤細胞的生長抑制作用

采用MTT法測定蛹蟲草培養基、子實體多糖提取物對Hepg2腫瘤細胞的生長抑制作用，實驗結果如圖2、3所示。①藥物質量濃度5 mg/mL時，所有藥物對Hepg2腫瘤細胞的抑制率與培養時間呈正相關；培養72 h后，培養基脫脂脫蛋白多糖A的抑制率為83.02%，培養基脫脂多糖B的抑制率為75.388%，培養基粗多糖C的抑制率為30.612%；100℃熱回流水提蛹蟲草子實體脫脂脫蛋白質多糖F72 h培養后，對Hepg2細胞抑制率平均值達到92.974%，超過了對照SB對Hepg2細胞抑制率，80℃熱回流水提蛹蟲草子實體多糖G72 h培養后，對Hepg2細胞抑制率平均值為67.09%，子實體多糖對肝癌細胞的抑制率與水提溫度呈正相關。②質量濃度為2.5～5 mg/mL，作用時間為72 h，多糖A對HepG2肝癌細胞的抑制率好于多糖B，而質量濃度為0.25～1 mg/mL的抑制率則相反，但絕對值較低。③藥物質量濃度 2.5 mg/mL 時，D、E、F、G，在48、72 h培養后，對Hepg2細胞抑制率均為正效應；藥物F、G，在48、72 h培養后，所有質量濃度對Hepg2細胞抑制率均為正效應。④藥物質量濃度1～0.25 mg/mL 時，24 h 培養后 D、E、F、G 對 Hepg2 細胞抑制率均為負效應。⑤除D外，所有藥物培養72 h后，對Hepg2細胞抑制率與濃度呈正相關。

圖2 蛹蟲草培養基提取物及對照SB對Hepg2腫瘤細胞的平均抑制率Fig.2 Production of mean estimate the marginal about different treatments

圖3 蛹蟲草子實體提取物及對照SB對Hepg2腫瘤細胞平均抑制Fig.3 Production of mean estimate the marginal about different treatments

由表9可知，培養72 h后，多糖A和F質量濃度為5、2.5 mg/mL時，對Hepg2細胞抑制率差異顯著，質量濃度為1～0.25 mg/mL時，對Hepg2細胞抑制率差異不顯著；但多糖A和F各自不同質量濃度處理對Hepg2細胞抑制率差異顯著，且抑制率與多糖質量濃度呈正相關。

表9 培養72 h后多糖F和多糖A對Hepg2腫瘤細胞的平均抑制率Table9 Average inhibition rate of against HepG2 tumor cell of F and A polysaccharide A after 72 h training

蛹蟲草子實體多糖抗腫瘤研究較多，效果也比較肯定。蛹蟲草基質多糖研究證明蛹蟲草基質多糖對酒精誘導的小鼠急性、亞急性肝損傷有明顯的保護作用[27]，抗腫瘤作用的相關研究尚少見報道。JING等[28]從蛹蟲草分離出一種新的低分子多糖（CMP-1），作用于 HepG2肝癌細胞 48 h后，IC50值為0.1763 mg/mL。本試驗多糖復合物 A、B、D、E、F、G在濃度小于1 mg/mL時，作用于HepG2肝癌細胞48 h后，抑制率均未超過50%，可以推測多糖成分的純化，一定程度上有利于對腫瘤抑制率的提高。同時葛曉宇[29]發現純化獲得質量濃度為2 mg/mL的蛹蟲草子實體酸性多糖（F2），培養48 h后，對HepG2肝癌細胞的抑制率達到27.9%。本試驗質量濃度為2.5 mg/mL培養基脫脂脫蛋白質多糖（A），作用于HepG2肝癌細胞48 h，制率達73.238%，培養72 h后抑制率達79.735%，培養基提純多糖表現出較高的抑制率。

3 結語

多糖的提取、分離和純化是相對復雜的工藝，多糖純度越高，提取成本越高。自然提取多糖產品開發需要綜合考慮開發產品的功效、成本和安全，本試驗旨在為最大限度提高產品的性價比提供一定的參考。本研究對蛹蟲草小麥培養基通過熱回流水提取法、超聲波提取多糖單因素試驗進行比較，得出熱回流水提法提取多糖效果較優，這與以往研究結果[5-7]一致。本試驗以蛹蟲草小麥培養基為原料，通過熱回流水提法正交試驗結合提取成本優化粗多糖提取工藝。結果表明提取溫度100℃、料液比1∶25、提取3次、每次提取時間90 min，為蛹蟲草小麥培養基粗多糖最佳提取工藝。不同提純處理后獲得的培養基多糖通過MTT試驗檢測其對HepG2肝癌細胞抑制率，結果表明質量濃度為5 mg/mL、培養時間72 h時，培養基提純多糖表現出較高的抑制率，培養基脫脂脫蛋白質多糖A對HepG2肝癌細胞抑制率＞脫脂多糖B＞未脫脂脫蛋白質粗多糖C；多糖抑制率與濃度和作用時間呈正相關，在一定范圍增加粗多糖的濃度和作用細胞時間，有利于對腫瘤細胞抑制率的提高。