響應(yīng)面法優(yōu)化青春雙歧桿菌增殖培養(yǎng)基

朱蒙蒙 ，李國瑩 ，顧秋亞 ，余曉斌 *

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122）

雙歧桿菌是動(dòng)物消化道內(nèi)具有益生作用的優(yōu)勢(shì)菌，促進(jìn)消化和礦物質(zhì)的吸收，維持腸道微生物平衡，改進(jìn)免疫系統(tǒng)反應(yīng)和提高對(duì)病原菌的抵抗力，降低癌癥、肥胖、糖尿病等疾病的風(fēng)險(xiǎn)，調(diào)節(jié)血脂及血清膽固醇水平，治療炎癥、自身免疫反應(yīng)、過敏，抗腫瘤，抗衰老等[1-3]。青春雙歧桿菌（B.adolescentis）是青年個(gè)體腸道中的優(yōu)勢(shì)菌，嬰兒出生2～3 d后青春雙歧桿菌開始增殖，5 d后達(dá)到最高峰并占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，在腸道內(nèi)菌群中占99%。但隨著人的年齡增高，青春雙歧桿菌在人體內(nèi)逐漸減少，體弱多病的老人腸道內(nèi)該菌幾乎消失，而健康的人仍能保持一定的青春雙歧桿菌在腸道內(nèi)存在。這也反映出人體腸道內(nèi)青春雙歧桿菌的數(shù)量乃是檢驗(yàn)人是否健康的一個(gè)指標(biāo)[4]。由于雙歧桿菌的嚴(yán)格厭氧，營養(yǎng)條件要求苛刻[5]，生長緩慢，對(duì)酸性環(huán)境抵抗力差，很難保持較高的活菌數(shù)。據(jù)報(bào)道，雙歧桿菌活菌數(shù)保持在106CFU/mL（或106CFU/g）以上才能有保健功效[6]，因此選擇增殖培養(yǎng)基是提高活菌數(shù)的重要手段之一。

目前提高雙歧桿菌培養(yǎng)液活菌數(shù)主要通過改善培養(yǎng)基組分實(shí)現(xiàn)。如改變培養(yǎng)基原有成分添加量[7]，或者培養(yǎng)基中添加增殖因子如低聚糖、氨基酸等[8-10]，或者植物浸出液培養(yǎng)基中添加碳源、氮源等成分[11-13]。大量文獻(xiàn)[14-17]采用正交試驗(yàn)對(duì)雙歧桿菌培養(yǎng)基中碳源、氮源、無機(jī)鹽、增殖因子等因素交互作用進(jìn)行有限的優(yōu)化，但這些方法的不足在于僅能比較各因素已選定水平的優(yōu)劣，無法提供未考察區(qū)域的信息[8]。MEENA等[18]采用響應(yīng)面優(yōu)化培養(yǎng)條件、碳源、氮源含量等，混合培養(yǎng)雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌；ABDUL等[19]采用響應(yīng)面優(yōu)化培養(yǎng)基中脫脂奶粉、酵母膏、葡萄糖，提高B.pseudocatenulatumG4生物量等，更加精確地確定培養(yǎng)基組分。

本研究中以青春雙歧桿菌為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，MRS（Man Rogosa and Sharpe Medium）為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，由低聚果糖和葡萄糖的復(fù)配代替葡萄糖，正交試驗(yàn)優(yōu)化復(fù)合氮源中胰蛋白胨、牛肉膏、酵母粉的含量，然后確定合適的碳氮總量和碳氮比，選擇合適的緩沖鹽濃度，最后用Box-Benhnken Design（BBD）試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)成分，在提高活菌數(shù)的同時(shí)縮短培養(yǎng)時(shí)間，為雙歧桿菌增殖培養(yǎng)奠定一定的理論與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種 青春雙歧桿菌（B.adolescentis）為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 脫脂乳培養(yǎng)基：10 g/dL脫脂奶粉，1 g/dL葡萄糖；MRS培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g，牛肉膏 5.0 g，酵母粉 5.0 g，葡萄糖 20.0 g，K2HPO4·3H2O 2.0 g， 檸檬酸銨 2.0 g， 乙酸鈉 5.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g， 吐溫-801.0 mL，MnSO4·H2O 0.05 g，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g，蒸餾水1000 mL，pH 6.5，121℃滅菌20 min；固體培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基+2 g/dL瓊脂。

1.2 儀器與設(shè)備

超凈工作臺(tái)：蘇州空氣凈化設(shè)備廠產(chǎn)品；鼓風(fēng)干燥箱：上海實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；紫外可見-分光光度計(jì)：上海尤尼柯儀器有限公司產(chǎn)品；PHS-3C酸度計(jì)：上海精科儀器有限公司產(chǎn)品；電子天平：常熟市百靈天平儀器有限公司產(chǎn)品；厭氧裝置：日本三菱公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化 將甘油管保藏的菌種涂布于固體培養(yǎng)，37℃厭氧培養(yǎng)36 h，用接種環(huán)挑取單菌落接種于脫脂奶粉培養(yǎng)基37℃厭氧培養(yǎng)36 h；以體積分?jǐn)?shù)2%接種量，取上述菌液于新鮮MRS培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，活化2次后備用。

1.3.2 吸光度和pH測(cè)定 菌體密度（A600nm）由紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定，pH由PHS-3C酸度計(jì)測(cè)定。1.3.3 活菌計(jì)數(shù) 采用稀釋涂布法，以10倍梯度稀釋，選取適當(dāng)稀釋度均勻涂布于固體培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)48 h后，計(jì)數(shù)[20]。

1.3.4 培養(yǎng)基優(yōu)化 先考察復(fù)配碳源（葡萄糖和低聚果糖質(zhì)量比為 3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3）、復(fù)配氮源組分、碳源總量（4、5、6 g/dL）與碳氮質(zhì)量比（3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3）、緩沖鹽體系質(zhì)量濃度（0、4.5、9.0、13.5、18.0 g/L）對(duì)青春雙歧桿菌生長的影響，再通過Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析確定最佳培養(yǎng)基組分，試驗(yàn)編碼與水平見表1。

1.4 生長曲線的比較

經(jīng)活化的菌種以體積分?jǐn)?shù)5%的接種量分別接種于MRS和增殖培養(yǎng)基，37℃厭氣培養(yǎng)，每隔4 h取樣測(cè)得吸光度A600nm，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的A600nm為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線[15]，同時(shí)測(cè)得培養(yǎng)基pH。

表1 試驗(yàn)編碼與水平Table1 Factors and levels of central composite design（g/L）

2 結(jié)果與分析

2.1 各因素對(duì)青春雙歧桿菌增殖的影響

2.1.1 碳源對(duì)青春雙歧桿菌生長的影響 碳源是影響微生物生長和代謝的最主要的因素之一。乳酸菌代謝產(chǎn)物主要是有機(jī)酸，其主要的元素為碳。葡萄糖是雙歧桿菌培養(yǎng)基中最主要的底物，低聚糖是一類雙歧因子，能夠促進(jìn)雙歧桿菌體外生長[21]，兩者復(fù)配作為最終碳源，對(duì)青春雙歧桿菌具有增殖作用。由圖1可以看出：當(dāng)葡萄糖與低聚果糖質(zhì)量之比為 1∶1 時(shí)活菌數(shù)最大，達(dá)到 6.3×108CFU/mL，MRS培養(yǎng)基中氮源碳源總量為2 g/dL，因此2種糖的添加質(zhì)量濃度均為10 g/L。

圖1 青春雙歧桿菌在復(fù)配碳源中活菌數(shù)Fig.1 Viable count of B.adolescentis with compound carbon sources

2.1.2 氮源的正交優(yōu)化 雙歧桿菌的生長需要復(fù)雜的氮源底物，豐富的氮源對(duì)其生長有較大的影響[11]。由表 2 得極差值RA＞RC＞RB，即胰蛋白胨促進(jìn)青春雙歧桿菌生長能力最強(qiáng)，其次是酵母粉、牛肉膏，得到最優(yōu)的氮源組合是A3B2C3，而由A600nm結(jié)果可知，培養(yǎng)基氮源組合8的菌體密度最高，即A3B2C1，因此需要作進(jìn)一步的驗(yàn)證。

表 2 氮源 L9（34）正交試驗(yàn)Table2 Orthogonal test L9（34） of nitrogen source

經(jīng)驗(yàn)證方案A3B2C3的A600nm為1.476，比組合8（A3B2C1）的試驗(yàn)結(jié)果高，所以確定最優(yōu)的氮源組合是A3B2C3，即胰蛋白胨、牛肉膏和酵母粉的質(zhì)量比為5∶3∶4，MRS 培養(yǎng)基中氮源質(zhì)量濃度為 2 g/dL，因此三者的添加質(zhì)量濃度分別是8.33、5.0、6.67 g/L。

2.1.3 碳氮總量與碳氮比對(duì)青春雙歧桿菌生長的影響 碳氮總量和碳氮比會(huì)對(duì)微生物的生長產(chǎn)生不同的影響。從圖2可以看到，當(dāng)培養(yǎng)基中的碳氮總量為6 g/dL，碳氮質(zhì)量比為1∶1時(shí)，青春雙歧桿菌的菌體密度最大，因此確定碳氮質(zhì)量濃度為6 g/dL，碳氮比為 1∶1。

圖2 不同碳氮總量和比例下的青春雙歧桿菌菌體密度Fig.2 Density of B.adolescentis with different concentration and proportion of carbon and nitrogen sources

2.1.4 緩沖鹽對(duì)青春雙歧桿菌生長的影響 雙歧桿菌代謝途徑中采用果糖-6-磷酸途徑進(jìn)行己糖發(fā)酵，產(chǎn)生乙酸、乳酸和少量的甲酸[22]，這些有機(jī)酸使得培養(yǎng)基pH值不斷降低，對(duì)細(xì)胞本身形成酸脅迫，抑制菌體的生長。緩沖鹽體系能夠與酸性物質(zhì)中和，對(duì)穩(wěn)定pH和降低對(duì)菌體生長的抑制方面起著很大的作用。結(jié)果表明：隨著緩沖鹽質(zhì)量濃度的增加，菌體密度越來越大隨后保持不變，所以緩沖鹽質(zhì)量濃度選用13.5 g/L，即檸檬酸銨、K2HPO4·3H2O、乙酸鈉分別為 3、3、7.5 g/L。

圖3 不同緩沖鹽質(zhì)量濃度下的青春雙歧桿菌菌體密度Fig.3 Density of B.adolescentis with different concentration buffer salt

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化增殖培養(yǎng)基配方

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，以碳源、氮源、緩沖鹽為自變量，OD600為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Benhnken Design（BBD）試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)中心組合試驗(yàn)。試驗(yàn)方案及結(jié)果見表3。

表3 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table3 Test design and results of Box-Benhnken

利用Design Expert 8.06軟件進(jìn)對(duì)表3中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合，得到青春雙歧桿菌菌體密度（Y）與培養(yǎng)基中的碳源（A）、氮源（B）、緩沖鹽（C）的多項(xiàng)回歸方程為：Y=1.48+0.062A-0.017B-0.047C+0.009AB+0.008AC+0.017BC-0.22A2-0.13B2-0.11C2。

2.2.2 Box-Benhnken方差分析 通過表4方差分析可得，該模型極顯著（P＜0.001），失擬項(xiàng)P=0.2114不顯著。模型確定系數(shù)R2=0.9954，矯正系數(shù)R2adj=0.9895，說明模型和試驗(yàn)設(shè)計(jì)相比擬合性比較高，很好地反應(yīng)青春雙歧桿菌菌體密度與培養(yǎng)基中碳源、氮源、緩沖鹽的關(guān)系。模型中一次項(xiàng)A、C極顯著，B顯著；交互項(xiàng)AB、BC、BC均不顯著；二次項(xiàng)A2、B2、C2均處于極顯著水平。

表4 Box-Benhnken方差分析Table4 Analysis of variance for Box-Benhnken

2.2.3 響應(yīng)面分析 利用Design Expert 8.06繪制出響應(yīng)面圖及其等高線圖（圖4～6）。其中等高線的形狀代表兩兩因素交互作用的強(qiáng)弱，圓形代表兩因素間的交互作用弱，橢圓則反之；等高線密集表明對(duì)響應(yīng)值影響較大，稀疏則表明影響較小。通過方程可得，二次項(xiàng)的系數(shù)均為負(fù)值，其所表征的拋物面開口向下，具有極大值點(diǎn)。經(jīng)軟件分析得到青春雙歧桿菌增殖培養(yǎng)基的最佳培養(yǎng)基配方：葡萄糖15.85 g/L、低聚果糖15.85 g/L、胰蛋白胨12.04 g/L、牛肉膏7.23 g/L、酵母粉9.63 g/L、檸檬酸銨2.75 g/L、K2HPO4·3H2O 2.75 g/L、乙酸鈉 6.875 g/L、吐溫-80 1.0 mL、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、MnSO4·H2O 0.05 g/L、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g/L。青春雙歧桿菌在該培養(yǎng)基成分下進(jìn)行5次平行試驗(yàn)，得到OD600的平均值為1.476，與預(yù)測(cè)值1.490擬合率達(dá)99.06%，優(yōu)化模型合理可靠。

圖4 碳源與氮源對(duì)青春雙歧桿菌生長影響的響應(yīng)面圖和等高線Fig.4 Response surface and contour plots for the effect of carbon source and nitrogen source on the growth of B.adolescentis

圖5 碳源與緩沖鹽對(duì)青春雙歧桿菌生長影響的響應(yīng)面圖和等高線Fig.5 Response surface and contour plots for the effect of carbon source and buffered salt on the growth of B.adolescentis

圖6 氮源與緩沖鹽對(duì)青春雙歧桿菌生長影響的響應(yīng)面圖和等高線Fig.6 Response surface and contour plots for the effect of nitrogen source and buffered salt on the growth of B.adolescentis

2.3 青春雙歧桿菌的生長曲線和pH的變化

從圖7中可以看出，青春雙歧桿菌在增殖培養(yǎng)基中沒有明顯的延滯期，28 h達(dá)到穩(wěn)定期，比優(yōu)化前縮短近12 h，此時(shí)活菌計(jì)數(shù)，培養(yǎng)基中活菌數(shù)達(dá)到8.9×109CFU/mL，是優(yōu)化前的1.73倍；在對(duì)數(shù)期，微生物的代謝產(chǎn)生大量的有機(jī)酸使得pH快速降低，在28 h后基本趨于穩(wěn)定，與優(yōu)化前相比pH降低速度過快并沒有對(duì)菌體生長造成抑制。

圖7 青春雙歧桿菌生長曲線和pH變化Fig.7 Growth curves and pH changes of B.adolescentis

3 結(jié) 語

利用響應(yīng)面法對(duì)青春雙歧桿菌增殖培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，得到增殖培養(yǎng)基配方：葡萄糖15.85 g/L、低聚果糖15.85 g/L、胰蛋白胨12.04 g/L、牛肉膏7.23 g/L、酵母粉 9.63 g/L、檸檬酸銨 2.75 g/L、K2HPO4·3H2O 2.75 g/L、乙酸鈉 6.875 g/L、吐溫-801.0 mL、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、MnSO4·H2O 0.05 g/L、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g/L。青春雙歧桿菌在增殖培養(yǎng)基中28 h達(dá)到穩(wěn)定期，比優(yōu)化前縮短12 h，活菌數(shù)達(dá)到8.9×109CFU/mL，是優(yōu)化前的1.73倍，在縮短培養(yǎng)時(shí)間的同時(shí)也提高了發(fā)酵液的活菌數(shù)。