三聚甲醛強降解菌的篩選鑒定及其對聚甲醛廢水的生物強化

葉姜瑜，李大榮，陸榆豐，李 媛，竇建軍

（1.重慶大學 城市建設與環境工程學院，重慶400045；2.重慶融極環保有限公司，重慶400000）

聚甲醛（Polyoxymethylene）是世界五大通用塑料之一，由于硬度大、剛度好、耐疲勞度高且自帶潤滑性，有“超鋼、奪鋼”之稱[1]，被廣泛應用于日用輕工、汽車、建材、農業、醫療器械等領域[2-4]。中國煤化工企業近年來發展迅速，很多煤化工企業建立了聚甲醛生產項目。不過，聚甲醛生產中產生的廢水含有甲醛、三聚甲醛（s-Trioxane，TOX）、二氧五環、甲縮醛和酚類等有害物質，具有鹽分高、化學需要量（COD）高等特征，很難生物處理至達標排放，對環境和人體有極大的危害，成為亟待解決的問題。目前針對聚甲醛廢水常見的處理方法有石灰法，高級氧化法如Fenton氧化法、濕式氧化法、臭氧催化氧化法，復合工藝法等[5]。但這些方法將產生大量化學污泥、條件要求苛刻、運行成本較高、工藝管理困難，因此應用受限。普通生物法雖然能克服以上缺點，但由于甲醛、TOX等有毒物質的抑制作用，許多微生物活性喪失，無法實現有效生物降解。

目前針對聚甲醛廢水中甲醛成分降解研究較多，且已分離出對甲醛具有代謝作用菌株，如產青霉素菌Penicillium chrysogenum[6]、蒙氏假單胞菌Pseudomonas monteilii[7]、紅串球菌Rhodococcus erythropolis[8]、惡臭假單胞菌Pseudomonas putida[9]等。不過，對聚甲醛廢水主要污染物之一TOX的生物降解研究仍較少，到目前為止仍少見TOX降解菌株的報道。我們馴化分離了一株以TOX為碳源的細菌，將其與甲醛降解菌群復合后進行了聚甲醛廢水的生物強化研究，結果表明其對聚甲醛類污水有良好的處理效果，可作為復合菌劑的組成成分。

1 材料與方法

1.1 菌源和水樣

菌株分離于某化工廠聚甲醛污水廠調節池底泥；活性污泥取自曝氣池；聚甲醛廢水取自于調節池。污水水質為：COD 3413 mg/L，HCOONa 3000～3500 mg/L，甲醛 135～250 mg/L，TOX 130～240 mg/L，DOX 37 mg/L，CH3OH 110 mg/L。

1.2 培養基

基本無機鹽培養基（g/L）：KH2PO40.7，K2HPO40.85，（NH4）2SO41.2，MgSO4·7H2O 0.1，CaCl20.01，FeSO4·7H2O 0.001，1×105Pa 滅菌 20 min。

LB 培養基（g/L）：蛋白胨 10，氯化鈉 10，酵母浸出粉 5，于 pH 7.0，1×105Pa 滅菌 20min。用于菌株富集擴培。

TOX降解菌培養基：基本無機鹽培養基高壓滅菌后加入一定量0.2 μm濾膜滅菌的TOX溶液。

1.3 菌株來源

TOX降解菌的分離純化：取10 mL底泥與污水混合物，加至LB培養基，于恒溫搖床30℃培養24 h；取5 mL所得擴培菌液，加至100 mL含TOX濃度為100 mg/L的LB培養基中，恒溫搖床30℃培養48 h，取菌液5 mL，如此反復接種所得菌液4～5次，每次接種LB培養基按梯度降低100 mg/L酵母粉，同時增加100 mg/L TOX，最后一次TOX濃度達500 mg/L；選擇最終菌液樣品于含400 mg/L TOX的LB固體培養基上稀釋涂布，并挑取所得菌落劃平板，培養48h；反復劃平板得到純菌株，-20℃下甘油保種備用。

甲醛降解菌：重慶大學城市建設與環境工程學院微生物分子生態學實驗室保存菌株麥芽糖假絲酵母（Candidamaltosa）和惡臭假單胞菌（Pseudomonsa putida）[10]。

1.4 菌株鑒定

形態學觀察：觀察菌株在LB固體培養基上形成的單菌落形態特征，包括菌落顏色、邊緣平整度和表面濕潤性等。用解剖針挑取少許培養皿上的菌落，混合于載玻片的無菌水滴中，光學顯微鏡下觀察其個體形態特征。

革蘭染色：對細菌進行革蘭染色：包括初染、媒染、脫色、復染等4個步驟，于光學顯微鏡下進行鑒別。

分子生物學鑒定：對單菌株進行基因組提取（參照細菌DNA提取試劑盒步驟）；對所得基因組采用細菌16S rDNA通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和 1 492R（5’-CGGYTACCTTGTTACGACTT-3）[11]進行擴增，將所得產物送與南京金斯瑞生物科技有限公司測序；利用NCBI軟件中的BLAST對實驗菌株的16S rDNA序列與GenBank數據庫中的已知序列進行同源性比較[12]。

1.5 環境因子對微生物生長影響的測定

菌株生長曲線測定：將活化后的分離菌株按體積分數1%接種于TOX質量濃度為100 mg/L的LB液體培養基；定時取樣測定菌液OD600值。

pH值對菌株生長的影響：恒溫培30℃培養，分別配制 pH 值梯度為 4、5、6、7、8 和 9，TOX 質量濃度為100 mg/L的LB培養基，按1%接種菌液，定時取樣測定OD600值。以時間為橫坐標，OD600為縱坐標，繪制菌株生長曲線。

溫度對菌株降解TOX的影響：設置20、25、30、35℃和40℃5個溫度梯度，于TOX濃度為400 mg/L的基本無機鹽培養基中加入體積分數為5%離心后的純菌體，24 h后取樣測定TOX降解率。

NaCl濃度對菌株生長的影響：以TOX質量濃度為100 mg/L的LB培養基為基質，分別配制NaCl質量濃度為 1、1.5、2、3 g/L 和 4 g/L 的培養基，按體積分數1%接種菌株，定時取樣測定OD600值，以時間為橫坐標，OD600為縱坐標，繪制菌株生長曲線。

菌株對不同質量濃度TOX的降解實驗：以前期實驗最優條件為基礎，配制TOX質量濃度分別為100、200、400、600、800、1100 mg/L 和 1500 mg/L不同梯度基本無機鹽培養基，菌液按體積分數2%離心（10000 r/min）并接種，以時間為橫坐標，TOX降解率為縱坐標繪制曲線。

以上均使用250 mL三角錐形瓶，搖床轉速為180 r/min。

1.6 指標測定

COD測定：HACH消解法[13]；甲醛測定：乙酰丙酮分光光度法；TOX測定：參照侯麗等[14]的頂空色譜毛細柱法方法。

1.7 聚甲醛廢水生物強化實驗

建立A、B、C和D共4組平行小試反應器。各反應器有效容積為3.5 L，啟動前均加入等量經該污水馴化后的活性污泥。A組：未加其他菌劑；B組：加入TOX降解菌；C組：加入甲醛降解菌；D組：同時加入TOX降解菌與甲醛降解菌。統一進水，曝氣，定時取樣測定各出水CODcr、甲醛和TOX。其中TOX降解菌和甲醛降解菌分別由TOX質量濃度為100 mg/L的LB培養基和甲醛質量濃度為100 mg/L的LB培養基搖床培養16 h后所得；各系統菌液按體積分數2%離心（10000 r/min）后投加；D組單菌與甲醛降解菌投加比例為1∶1。

2 結果與討論

2.1 TOX強降解菌的分離鑒定及生長曲線

通過底泥富集馴化、分離，獲得幾株TOX降解菌株。其中一株Q1優勢菌生長良好，其菌落形態米白色，表面干燥，邊緣光滑齊整，中間凹陷，菌落較厚（圖1）；顯微鏡形態呈桿狀：革蘭染色陽性（G+）。對該菌株進行16S rDNA基因測序，其結果與GenBank數據庫比對，該菌被確定為與最高同源性98%的甲基營養型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）相同。對其進行生長曲線測定，結果表明，接種4 h內，OD600值上升較為平緩，為該菌適應期；隨后進入對數期，菌株呈現快速增長；16 h進入穩定期初期，此時活性較好，被確定為接種期。

圖1 菌株B.methylotrophicus的形態學特征Fig.1 Morphological identification of B.methylotrophicus

2.2 環境因子對B.methylotrophicus生長的影響

聚甲醛污水中污染物質（如TOX、二氧五環等）組分及含量都有很大的不確定性，COD變化大，且正常生產情況下水質偏酸性、工段投加大量NaOH等原因，使得聚甲醛廢水含鹽質量分數為1.5～2.5 g/L，屬于高鹽類工藝廢水。環境因子pH值、溫度和離子濃度等對菌株B.methylotrophicus生長的影響見圖2～4。

圖2 pH值對菌株B.methylotrophicus生長的影響Fig.2 Effects of pH on activities of B.methylotrophicus

圖3 溫度對B.methylotrophicus降解TOX的影響Fig.3 Effects of temperature on degradation of B.methylotrophicus to TOX

圖4 NaCl質量濃度對菌株B.methylotrophicus生長的影響Fig.4 Effects of NaCl concentration on activities of B.methylotrophicus

由圖2可知，菌株對pH變化較敏感，酸堿對該菌的影響都較大。培養基pH值為7時，菌株進入穩定期時間提前至16 h，此時OD600峰值相對最高，確定其最佳生長pH為7。而當溫度為30℃時，該菌有最高的TOX降解率91.63%（圖3），表明該菌株屬于中溫微生物類型。由圖4可看出，鹽離子濃度對該菌的影響較大，隨著NaCl質量濃度的提高，菌株適應期逐漸加長、穩定期種群數量下降。當NaCl質量濃度為1、1.5 g/L和2 g/L時，生長曲線表明該菌有較好的適應性；NaCl質量濃度超過3 g/L以后，菌株生長受到較明顯抑制，穩定期時種群數量明顯下降。生產性聚甲醛廢水的鹽濃度應在該菌耐受范圍內。

2.3 菌株B.methylotrophicus對不同濃度TOX的降解

B.methylotrophicus對TOX的降解效率見圖5。當TOX質量濃度為100～400 mg/L時，菌株能迅速適應底物，并以TOX作為碳源實現快速降解，在24 h內TOX降解率可達90%左右；隨著底物濃度的逐步提高，菌株適應期隨之變長，但600 mg/L以下都有較好的降解率；當TOX質量濃度提升至1200 mg/L時，在40 h內TOX降解率僅為21.84%，表明TOX對該菌已表現出明顯的抑制性，對菌株表現出極大毒性，初步判定菌株B.methylotrophicus對TOX降解的耐受濃度為1200 mg/L。

圖5 不同TOX質量濃度下菌株B.methylotrophicus的降解率Fig.5 Degradation of B.methylotrophicus to different TOX concentration

2.4 聚甲醛廢水的生物強化處理

聚甲醛廢水COD的主要構成為HCOONa、甲醛、TOX和醇類等，其中甲醛與TOX為主要有毒物質。對該污水生物強化處理后反應系統最終出水水質及降解率見表1，其降解趨勢見圖6。

表1 各系統出水污染物濃度及其降解率（60 h）Table1 Concentration of pollutants in effluents and its degrading efficiency（60 h）

圖6 反應系統中COD降解時的甲醛、TOX濃度變化Fig.6 Variation of formaldehyde,TOX and COD in Systems

由圖6可知，系統啟動后，各組COD均呈下降趨勢，其中A組較為平緩，B、C組次之，D組最快；A組最終出水的COD降解率僅為75.16%，而D組最終降解率達92.80%（表3）。此外，各系統COD均隨甲醛、TOX的降低而降低，對照組A的甲醛和TOX降速都極為緩慢，而B組的甲醛、TOX降解速率與降解率均有一定提高，其降解率分別為72.16%和55.97%，但TOX相對A組降解率僅提高了25.69%。C組的甲醛降解率高達94.89%，但對TOX降解率仍極低為30.45%，相對A組變化也不大。而D組由于同時加入了甲醛降解菌與TOX降解菌B.methylotrophicus，其甲醛和TOX的降解率都有明顯提高，達96.52%和95.88%，同時COD降解率也提高至92.80%，其各項指標均遠優于A、B、C組。

本研究顯示，當僅加入B.methylotrophicus時，由于受到其他如甲醛等物質的抑制作用，并不能發揮其最佳活性將TOX完全降解（如圖6 B）；僅加入降甲醛混合菌時，雖甲醛去除率高，但缺少TOX的降解菌，TOX的質量濃度較高，仍然抑制了活性污泥中的其他微生物群落，致使其COD降輻相對B組變化不大（如圖6（c））；當同時加入TOX降解菌與甲醛降解菌時，菌株之間展示出良好的協同作用，實現了甲醛、TOX的同步快速降解，消除了抑制微生物的毒性物質，從而其他COD降解菌種群逐漸增強、COD隨之大大降低。總體看來，各處理組出水水質優劣為：D組（TOX降解菌+甲醛降解菌）＞C組（甲醛降解菌）＞B組（TOX 降解菌）＞A 組（對照組）。因此，無論是B.methylotrophicus，還是甲醛降解菌單獨的生物強化，均只能實現單一有毒物質的部分降解，只有多菌株生物強化后協同降解聚甲醛廢水的有毒底物，才能真正有效地實現聚甲醛廢水的生物處理。

3 結 語

本研究以TOX作為單一碳源分離了一株編號為Q1的TOX降解菌，經形態與分子生物學鑒定為甲基營養型芽孢桿菌（B.methylotrophicus），其在100 mg/L TOX的LB培養基中培養16 h進入穩定期，最佳生長pH和溫度分別為7℃和30℃，NaCl耐受度低于3%，TOX耐受度低于1200 mg/L。在對聚甲醛廢水的生物強化處理中，該菌和甲醛降解菌同時加入的處理效果要優于其他組合，表明該生物強化菌劑消除了抑制微生物群落的主要毒性物質，促進了聚甲醛降解微生物種群的增殖和對有毒廢水COD的有效降解，對聚甲醛廢水的處理工程具有重要的應用價值。