離子液體預處理對玉米秸稈酶解效率的影響

胡曉會 ，程 力 *，顧正彪 ，洪 雁 ，李兆豐 ，李才明

（1．食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122；2．江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；3.江南大學 食品營養與安全協同創新中心，江蘇 無錫214122）

隨著化石能源的日益短缺及環境污染日趨嚴重，發展和利用產量巨大、來源豐富的綠色可再生資源木質纖維素意義重大。木質纖維素作為地球上最豐富的可再生資源之一[1-2]，主要來源于木材及農作物秸稈，含纖維素、半纖維素和木質素3個主要組分[3]。纖維素是由D-葡萄糖通過1，4糖苷鍵連接而成的多糖，纖維素中含有大量氫鍵，難溶于一般有機溶劑[4]；半纖維素是由不同種糖單元組成的復合聚糖[5]；木質素作為細胞壁的主要成分之一，是由苯基丙烷單元通過醚鍵、碳-碳鍵連接而成的復雜、無定型的高聚物[6]。木質素和半纖維素通過共價鍵形成緊密鏈接并包裹著纖維素，木質素的存在不僅不可逆地吸附纖維素酶，還阻止酶與底物接觸[7]。對木質纖維素進行高效酶解并以此為基礎轉化為燃料乙醇和各類化工產品，需要對其進行預處理以打破木質纖維素的致密結構，除去木質素等抑制組分，并降低纖維素的結晶度。

傳統的預處理方法包括物理法、化學法、物理化學法和生物法，但多數存在環境污染大，生產效率低等缺點[8-11]。離子液體是由有機陽離子和有機或無機陰離子構成的在室溫或接近室溫下熔融的鹽。作為新型綠色溶劑，離子液體對木質纖維素組分有良好溶解性能，且具有不揮發、環境污染小、可重復使用等優點[12-13]。纖維素溶于離子液體后，通過加入反溶劑可以使纖維素再生出來，經過過濾、洗滌和干燥就能得到非晶態的、更易被酶解的再生纖維素。另外，通過改變生成再生纖維素的過程與條件，可制成不同結構與形狀的纖維素材料，如粉末狀、珠狀、纖維狀及片狀等。研究表明，離子液體對木質纖維素各組分的溶解效果與離子液體的種類有關。體積小、極性強的氯離子對纖維素有較好的溶解性，而[BF]、[PF]、[NTf]等陰離子對纖維素的溶解性較差[14]。

目前關于離子液體預處理木質纖維素的研究較少，對纖維素或木質素有較好溶解性的離子液體預處理木質纖維素后底物的酶解效率不一定高[15-16]。為了研究不同類型的離子液體對木質纖維素各組分溶解效果的差異及預處理后底物物料成分、結構及理化性質的改變，及這些改變與酶解效率之間的關系，本論文選用4種不同類型的離子液體：1-乙基-3-甲基咪唑醋酸鹽（[Emim]Ac）、1-烯丙基-3-甲基咪唑氯鹽（[Amim]Cl）、1-丁基-3-甲基咪唑硫酸氫鹽（[Bmim]HSO4）、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸（[Bmim]BF4）對木質纖維素進行預處理，比較并分析了木質纖維素成分、形貌和結構的改變對酶解效率的影響，總結出影響木質纖維素酶解效率的主要因素，以期對木質纖維素相關預處理提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

玉米秸稈，由長春大成玉米開發有限公司提供，4種離子液體1-乙基-3-甲基咪唑醋酸鹽（[Emim]Ac）、1-烯丙基-3-甲基咪唑氯鹽（[Amim]Cl）、1-丁基-3-甲基咪唑硫酸氫鹽（[Bmim]HSO4）、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸（[Bmim]BF4），均購自上海成捷化學有限公司；纖維素酶（ATCC 26921，45 FPU/mL）、堿木質素、微晶纖維素和木聚糖，均購自Sigma公司；濃硫酸、碳酸鈣、檸檬酸、檸檬酸鈉、3，5-二硝基水楊酸等，均為分析純試劑，購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 纖維素、半纖維素和木質素在離子液體中的溶解度測定 溶解度測定方法參照LEE等[17]的方法稍加改動。[Bmim]BF4對木質素溶解能力較差，取50 mg木質素加入1 g[Bmim]BF4中，90℃下磁力攪拌12 h，10000 r/min離心1 min，取0.1 g懸浮液加入0.9 mL 0.1 moL/L NaOH溶液，以木質素為標準品用分光光度計在280 nm處測定木質素含量；[Amim]Cl、[Bmim]HSO4、[Emim]Ac 對木質素的溶解能力較好，因此，分別取0.5 g木質素加入5 g離子液體中，90℃下磁力攪拌，若完全溶解，再加0.5 g木質素，12 h內累計木質素添加量為其溶解度。

4種離子液體的纖維素和半纖維素的溶解度測定方法：取0.5 g微晶纖維素或木聚糖，加至5 g離子液體中90℃下磁力攪拌，若完全溶解，再加0.5 g微晶纖維素或木聚糖，12 h內累計微晶纖維素或木聚糖添加量為其纖維素或半纖維素溶解度。

1.2.2 玉米秸稈離子液體預處理 將風干后的物料粉碎并篩選40～60目顆粒備用。取2.5 g物料和50 g離子液體置于250 mL耐壓瓶中，130℃烘箱中放置1.5 h，取出，冷卻至室溫后，向體系中緩慢加入100 mL去離子水，離心、沉淀洗滌至上清液無色，置于50℃烘箱中烘干備用[15]。所有試驗平行3組。

式（1）中，A為回收率；A0為原樣品質量；A1為預處理后樣品質量。

1.2.3 離子液體預處理前后纖維素酶酶解 分別取1 g預處理前后的樣品，加入適量的纖維素酶（25 FPU/g）和pH值為4.8的0.05 moL/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液，50℃、100 r/min條件下進行酶解糖化反應，定時取樣，沸水滅活，過0.45 μm水系膜，采用高效液相法（HPLC）測定水解液中葡萄糖含量。

式（2）中，B為酶解效率；B1為酶解產生的葡萄糖量；B1為材料所含纖維素量。

1.3 分析方法

1.3.1 成分分析 玉米秸稈中纖維素、半纖維素和木質素含量的分析參照美國能源部可再生能源實驗室（NREL）的方法進行測定[18]。

1.3.2 掃描電子顯微鏡（SEM）分析 玉米秸稈固定在樣品臺上，離子濺射儀濺射噴金，然后在日立 S-4800場發射掃描電子顯微鏡（日本日立株式會社）下觀察纖維素的形態。

1.3.3 X-ray衍射分析 預處理前后玉米秸稈的X-衍射結晶度通過D8 Advance型X-衍射分析儀（德國 Bruker AXS公司）測得。掃描范圍 10°～40°，掃描速度2°/min，掃描電壓與電流分別為40 kV、40 mA。

1.3.4 熱重分析 采用梅特勒-托利多儀器有限公司TGA/SDTA851e熱重分析儀來測定預處理前后秸稈樣品的熱穩定性，分別將5 mg左右預處理前后的秸稈材料置于坩堝容器內，在N2保護下，以15℃/min的加熱速率從25℃升溫至500℃，記錄樣品質量隨溫度變化的關系曲線。

1.3.5 傅里葉紅外光譜（FT-IR）分析 取預處理前后的樣品以1∶100比例同溴化鉀混勻后，研磨至約300目粉末，壓片，利用Nicolet iS10型傅里葉變換紅外光譜儀（美國Thermo Scientific公司），掃描波長范圍是 4000～400 cm-1，分辨率是 2 cm-1，掃描32次，空氣為背景。

2 結果與討論

2.1 秸稈主要組分在離子液體中的溶解度

要選擇出處理效果較好的離子液體，需要考慮3方面因素：1）離子液體對木質素、纖維素和半纖維素的溶解度；2）離子液體從原料中選擇性提取木質素的能力；3）預處理后物料的酶解效率[19]。木質素與半纖維素通過共價鍵結合形成致密網狀結構包裹著纖維素，因此，需要離子液體對各組分有一定的溶解度并能打破木質素與半纖維素之間的共價鍵才能有效地將木質素提取出來增加纖維素酶與底物的可及性從而提高酶解效率[20]。由表1可知，[Emim]Ac和 [Amim]Cl對木質纖維素各組分都有較好的溶解效果，[Bmim]HSO4對木質素和半纖維素有較好的選擇性溶解效果，而[Bmim]BF4對木質纖維素各組分都基本不溶。

2.2 離子液體預處理前后秸稈的成分分析和酶解效率

結合表1和表2可以看出，木質素的去除可以有效地提高物料的酶解效率。[Emim]Ac和[Amim]Cl對木質纖維素各組分都有較高的溶解度，其木質素去除效果也較好，預處理后物料的酶解效率也較高。另外，[Emim]Ac具有較好的選擇性去除木質素的效果，即在預處理過程中保留了可以被酶解的纖維素和半纖維素，除去了阻礙底物酶解的木質素，保證底物的物料得率，節約資源降低成本。

[Bmim]HSO4對木質素和半纖維素溶解效果較好，但其木質素去除效果并不理想，其酶解效率也較低。[Bmim]BF4對木質纖維素的各個組分溶解效果并不理想，但預處理后去除木質素的能力大于[Bmim]HSO4，酶解效率與[Amim]Cl預處理后物料的酶解效率相當。為了進一步研究預處理對物料酶解效率的影響因素，對預處前后物料的理化性質進行分析。

表1 堿木質素、微晶纖維素和木聚糖在離子液體中的溶解度Table1 Solubility of lignocellulose constituents in ionic liquid

表2 離子液體預處理前后秸稈成分分析和酶解效率（±s）Table2 Constituents of corn stalk before and after pretreatment by different ionic liquid（±s）%

表2 離子液體預處理前后秸稈成分分析和酶解效率（±s）Table2 Constituents of corn stalk before and after pretreatment by different ionic liquid（±s）%

注：酶解條件：1 g樣品，25 FPU/g纖維素酶，50 mmoL/L緩沖液（pH 4.8），酶解體系為 100 mL，50℃，100 r/min，酶解時間為 12 h；同列不同小寫字母表示不同處理之間在0.05水平存在顯著差異

離子液體回收率纖維素15.79±0.45 d半纖維素木質素10 0.00±0.00 a 原材料15.77±0.45 b 30.89±0.30 a 24.27±0.35 a 76.61±0.56 c [E m i m]A c 28.01±0.30 b 11.02±0.45 d 91.20±0.25 a[A m i m]C l 18.47±0.50 d 68.42±0.43 d 16.60±0.43 a 13.75±0.38 c 28.37±0.34 c[B m i m]H S O 4[B m i m]B F 4 75.30±0.55 c 25.37±0.51 c 10.29±0.42 e 10.11±0.21 e 16.25±0.19 b 12.41±0.53 e 79.24±0.29 b 28.91±0.89 b 11.58±0.28 d酶解效率12.93±0.28 c 29.49±0.25 b

2.3 離子液體預處理前后玉米秸稈物理化學結構分析

2.3.1 掃描電子顯微鏡（SEM）分析 從圖1可看出，未經預處理的木質纖維素結構平滑致密，與纖維素酶接觸位點有限，酶解效果比較差，預處理后的木質纖維素表面發生較大變化，致密平滑的結構被破壞，變得疏松多孔，這可能是由于除去了木質素、半纖維素和無定型纖維素導致的，疏松的結構為纖維素酶提供較多的接觸位點，木質素的去除減少了纖維素酶的無效吸附，因此預處理后木質纖維素的酶解效率較原材料高。其中，相比于其他3種離子液體，[Emim]Ac預處理后物料最為疏松多孔，纖維素酶更易進入物料內部與底物接觸，預處理后物料的酶解效率較其他3種離子液體高。

圖1 離子液體預處理前后秸稈電鏡圖（×1200）Fig．1 SEM imagines of corn stalk before and after pretreatment by different ionic liquids（×1200）

2.3.2 X-ray衍射分析 由圖2可以看出，預處理前2θ=15.26°、22.54°的峰為纖維素晶型 I的出峰位置，[Emim]Ac預處理后2θ=15.26°處的峰消失，在 2θ=22.1°處有峰，說明預處理后纖維素發生了晶型的轉變，由晶型I轉變為更易被酶解的晶型II[21]，因此[Emim]Ac預處理過后的秸稈由于結晶型纖維素轉變為更易被酶解的無定型纖維素從而酶解效率提高至91.20%，SAMAYAMIP等[22]通過實驗也說明了晶型的轉變有利于酶解。相對于[Emim]Ac的預處理效果，其他3種離子液體在130℃、1.5 h處理條件下并沒有改變纖維素的晶型，且2θ=22.54°處的峰較原材料更尖銳，許多研究者在木質纖維素預處理過程中發現了類似的現象，這是由于預處理除去了原材料中無定型纖維素而導致其相對結晶度增大。

2.3.3 熱重分析 生物質中不同組分的熱穩定性差異很大，其中，纖維素和木質素含量是生物質熱穩定性的重要影響因素[23]。不同離子液體預處理后秸稈的熱穩定性如圖3所示。從圖3中可以看出，預處理前后秸稈的主要降解溫度為200～400℃，未經處理的秸稈在348℃時質量百分比降至50%，而[Emim]Ac、[Amim]Cl、[Bmim]HSO4預處理過后的秸稈分別在270、329、330℃降至初始質量的50%，這是由于預處理過程中離子液體進入到物料內部導致秸稈疏松多孔，因此預處理后物料熱穩定性有所下降。其中，[Emim]Ac預處理后的秸稈熱穩定性最差，是由于[Emim]Ac預處理過程中纖維素由結晶纖維素轉變為無定性纖維素從而導致樣品易被熱降解。[Bmim]BF4處理后的樣品則在352℃質量百分比降至50%，與預處理前物料相當，是由于[Bmim]BF4對木質纖維素各個組分溶解能力較差而無法滲透至物料內部形成疏松多孔結構。

圖2 離子液體預處理前后秸稈的XRD譜圖Fig．2 XRD imagines of corn stalk before and after pretreatment by ionic liquids

圖3 離子液體預處理前后秸稈熱重分析曲線Fig．3 Thermogravimetric analysis of corn stalk before and after pretreatment by different ionic liquids

當溫度加熱至500℃時，預處理前后的秸稈均有少量殘余物，是在N2環境中產生的富碳化合物[24]，但可以明顯的看到預處理后樣品殘余物量低于原材料，是由于離子液體預處理去除了部分木質素和灰分，因此殘余物量較少[25]。

2.3.4 FT-IR分析 由預處理前后物料的FT-IR圖4可以看出，預處理后木質素芳環骨架的特征吸收峰1512 cm-1明顯減弱，這表明在預處理過程中木質素被脫除或被破壞[26]。[Amim]Cl、[Bmim]BF4和[Emim]Ac預處理后半纖維素中的羰基C=O伸縮振動1732 cm-1基本消失，木質素和半纖維素之間CO伸縮振動信號峰1249 cm-1強度減弱，說明預處理打破了半纖維素和木質素之間的連接酯鍵[27]，而[Bmim]HSO4預處理后的木質纖維素在1732 cm-1處的信號峰只是有所減弱并沒有消失，說明[Bmim]HSO4預處理破壞半纖維素和木質素鏈接酯鍵的能力不如[Amim]Cl、[Bmim]BF4和[Emim]Ac，而破壞半纖維素和木質素的能力與預處理后物料的酶解效呈正相關，此結果與表2中酶解效果一致，這與DEMARTINI等[28]在研究細胞壁乙醇發酵過程中得出的結論一致。

圖4 離子液體預處理前后秸稈的FT-IR譜圖Fig．4 FT-IR imagines of corn stalks before and after pretreatment by different ionic liquids

3 結語

實驗結果表明，[Amim]Cl、[Bmim]BF4和[Emim]Ac預處理都可提高秸稈的酶解效率。其中，[Emim]Ac預處理可以選擇性地去除木質素，減少纖維素酶的無效吸附；打破木質素和半纖維素之間的共價鍵，破壞包裹著纖維素的緊密的網狀結構使纖維素暴露；處理后秸稈中結晶纖維素轉化為更易被酶解的無定型纖維素，大幅度提高了纖維素的酶解效率。這些預處理后理化性質的改變有效地提高了玉米秸稈的酶解效率，相比于原材料提高了4.77倍。