麻花秦艽不同組織部位可培養內生菌群結構及其與龍膽苦苷含量的相關性

陳 昕 ，李 琪 ，2，曹倩倩 ，黃春萍 *，2

（1.四川師范大學 生命科學學院，四川 成都 610068；2.農田生態服務能力建設四川省高校工程中心，四川 成都610068）

植物內生菌包括真菌、細菌和放線菌，主要存活于健康植物組織內部，但不引發宿主植物表現出明顯感染癥狀的微生物類群[1-2]。植物內生菌可產生與宿主植物相同或者相似的具有生物活性的代謝產物，包括萜類、芳香類、多肽類等化合物[2-4]。同時，這些活性成分通常具有抗腫瘤、抑菌和殺蟲等作用，且代謝產物豐富，是新型藥物的潛在資源[5-6]。藥用植物內生菌多樣性的研究對進一步探索內生菌與宿主植物間的生態關系、反應宿主植物的生存環境和生長狀態、生物學資源的開發等具有重要意義。

麻花秦艽（Gentiana stramineaMaxim）為龍膽科龍膽屬多年生草本植物，在我國有2000多年的種植歷史，廣泛分布于四川西北地區、青海大部分地區和甘肅、西藏、寧夏部分地區[7]，是我國三級重點保護野生藥材之一[8-9]，具有退虛熱、止痹痛、清濕熱、祛風濕的功效，可用于治療中風半身不遂、風濕痹痛、骨節酸痛、筋脈拘攣、骨蒸潮熱、濕熱黃疸、小兒疳積發熱等癥狀[7]。秦艽具有環烯醚萜類、黃酮類、生物堿和其他化學成分，以環烯醚萜為其特征成分[10-11]，這些活性成分含量在其不同組織中存在明顯的差異[12]。內生菌復雜的群落結構是秦艽植物環境的一個重要組成，對其生長具有明顯的影響，如：次級代謝產物的積累、藥材質量、藥材道地性等等[13-14]。同時，內生菌和植物之間密切的共生關系使內生菌能影響植物有效成分的合成，或者內生菌自身便合成某些有效成分[15]。

然而，目前對麻花秦艽植物資源的研究主要集中在其化學成分、資源開發和藥理藥效等方面[16-18]，對該植物內生菌群結構的研究報道非常有限。另一方面，隨著對秦艽植物需求量猛增，長期采挖和環境惡化，使野生秦艽資源遭到嚴重的破壞，最終制約了秦艽植物資源的健康發展。秦艽內生菌多樣性及其相關研究對于探索秦艽與其內生菌之間的互動機制、反映秦艽的生長狀態和生存環境、開發具有超常生態和醫學功能的生物資源等均具有重要意義。本研究中將通過對麻花秦艽根、莖、葉和花等不同組織部位中的可培養內生菌的數量和組成等結構進行分析，探討麻花秦艽可培養內生菌結構與其主要藥效成分龍膽苦苷含量之間的關系，以期為秦艽內生菌的資源情況及內生菌生物活性成分研究奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣品來源 麻花秦艽于2015年夏季采自四川理縣米亞羅（31°14′—31°19′N，102°53′—102°57′E，海拔 2458～4619 m）。

1.1.2 培養基 牛肉膏蛋白胨培養基[19]（g/L）：牛肉膏 3，蛋白胨 10，氯化鈉 5，瓊脂 20，pH 7.0～7.2；馬?。∕artin）培養基[19]（g/L）：葡萄糖 10，蛋白胨 5，磷酸二氫鉀1，瓊脂20，1/3000孟加拉紅100 mL/L，臨用前加0.03%鏈霉素稀釋液100 mL/L，自然pH。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 取麻花秦艽植株用自來水沖洗，去除表面的泥土，室溫晾干。將清洗的秦艽根、莖、葉、花用滅菌手術刀切成1 cm見方的小塊（段、片），切掉表層。然后轉到無菌操作臺上進行消毒：無菌水漂洗2次，75%乙醇浸泡2 min，0.01%汞浸泡4 s，無菌水沖洗3次[20]，以備內生菌分離純化用。

1.2.2 菌株的分離純化 將處理后的各組織置于滅菌研缽中，加入9 mL無菌水，研磨成勻漿菌懸液，將制備的菌懸液10倍梯度依次稀釋至1×10-1～1×10-5，分別取 100 μL涂布于牛肉膏蛋白胨培養基和馬丁氏培養基，每個處理重復3次。細菌置于37℃培養，真菌置于25℃培養。在同樣培養條件下放置相應空白培養基，同時吸取1.2.1中樣品處理時最后一次無菌水沖洗液各100 μL涂布牛肉膏蛋白胨和馬丁平板做相應的對照培養，若培養后無細菌或真菌長出，證明表面消毒徹底[21-22]。培養2～3 d后，培養基中可見有菌落形成，計算菌落數。根據菌落形態、顏色等的大小、形狀、邊緣、光澤、質地、顏色和透明程度等挑取單菌落轉接（劃線）入對應的培養基中純化培養[23]。

1.2.3 內生菌的鑒定 按照文獻[20]方法對細菌進行常規形態鑒定。根據《真菌鑒定手冊》[24]，對真菌進行常規形態鑒定。細菌和真菌總DNA的提取分別采用康為世紀（北京）生物科技有限公司細菌和真菌基因組DNA提取試劑盒按標準操作流程進行。按照文獻[1，17]方法，采用27F/1429R引物擴增細菌16S rRNA基因片段。按照文獻[25]方法，采用ITSI/ITS4擴增真菌18S rRNA基因片段。得到的PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶回收后由擎科生物有限公司進行序列測定。測序得到的核苷酸序列在NCBI上GenBank中進行BLAST分析，采用MEGA 4軟件對序列進行相似性分析，并以Neighborjoining方法構建系統發育樹，用Bootstrap（1000次重復）進行檢驗。

1.2.4 龍膽苦苷相對含量檢測 麻花秦艽主要藥用成分龍膽苦苷的檢測按照文獻[26]的方法采用HPLC檢測。麻花秦艽各組織部位龍膽苦苷的含量見表1。

表1 麻花秦艽根、莖、葉、花中龍膽苦苷相對含量（n=3）Table1 Gentiopicrin contents in roots，stems，leaves and flowers of Gentiana straminea Maxim（n=3）

1.3 數據處理

采用SPSS17.0統計軟件進行單因素方差分析，多重比較采用最小顯著差異法（LSD）。微生物數量與龍膽苦苷含量的相關關系采用Pearson法。數據整理、計算與作圖均采用Microsoft Excel 2013軟件。

2 結果與討論

2.1 麻花秦艽不同組織部位可培養內生菌數量

通過稀釋涂布法，對麻花秦艽各組織部位可培養內生細菌和內生真菌進行檢測，結果見表2。根中的可培養內生細菌和真菌的數量最高，分別為（8.77±0.71）×105cfu/g 和（2.00±1.05）×104cfu/g；莖中的可培養內生細菌顯著性低于其他組織，并且從莖和花中沒有分離到可培養內生真菌。內生菌的種類和數量會受到不同分離部位的影響[26]，同時大量的研究發現藥用植物內生菌與其活性成分存在一定的相關性[27-29]。麻花秦艽不同分離部位龍膽苦苷含量存在顯著性差異（表1），這可能是導致其各部位內生菌數量存在顯著性差異的主要原因（表3）。

2.2 麻花秦艽可培養內生細菌的鑒定

從麻花秦艽的不同組織中共分離到內生細菌10 株（QJ1～QJ10），其形態特征見表 4。

表2 麻花秦艽不同組織部位內生細菌與內生真菌數量（±s）Table2 Quantity of the endophytic bacteria and fungi in the different parts of Gentiana straminea Maxim（±s）cfu/g

表2 麻花秦艽不同組織部位內生細菌與內生真菌數量（±s）Table2 Quantity of the endophytic bacteria and fungi in the different parts of Gentiana straminea Maxim（±s）cfu/g

注：不同小寫字母表示內生細菌或內生真菌的數量在不同組織部位中差異性顯著（P＜0.05）。

組織部位真菌數量細菌數量根(2.00±1.05)×10 4a 0 b 莖(8.77±0.71)×10 5a(2.13±1.55)×10 3 b葉(1.00±0.30)×10 5c (1.00±0.90)×10 c花(3.43±1.12)×10 5c 0 b

表3 可培養內生菌數量與龍膽苦苷相對含量的相關性分析Table3 Correlation analysis of quantity of the cultivable endophytes and content of gentiopicrin of Gentiana straminea Maxim

表4 麻花秦艽可培養內生細菌形態與培養特征Table4 Morphological and cultured characteristics of culturable endophytic bacteria in Gentiana straminea Maxim

對菌株QJ1～QJ10進行16S rDNA基因測序，測序結果在GenBank進行同源性比對，結果見表5。菌株QJ1與伯克霍爾德菌（Burkholderiasp.，登錄號KJ004488.1）的同源性為 99%；QJ4與短小桿菌（Curtobacteriumoceanosedimentum，登 錄 號JF460771.1）的同源性為100%；QJ5與假單胞菌（Pseudomonassp.，登錄號 KM253123.1）的同源性為99%；QJ6與拉恩菌（Rahnellasp.，登錄號KT580643.1）的同源性為 99%；QJ7與假單胞菌（Pseudomonassp.，登錄號 JQ511859.1）的序列同源性為97%以上，構建系統發育樹（圖1）后，分別位于同一系統發育分支上；QJ8與新鞘氨醇單胞菌（Novosphingobiumsp.，登錄號 KM252978.1）的序列同源性為 100%；QJ10與假單胞菌（Uncultured pseudomonassp.，登錄號 GU201572.1）的序列同源性為99%。另外，QJ2和杜搟菌（Duganellasp.，登錄號KF424273.1）的序列同源性最大，但只有90%；QJ3與不可培養細菌（Uncultured bacterium，登錄號DQ984599.1）和黃單胞菌（Xanthomonadaceae bacterium，登錄號JN872548.1）的序列同源性為最大，但均只達 93%；QJ9 與泛菌（Pantoeasp.，登錄號JN853256.1）的序列同源性最大，但只達88%。綜合同源性比對結果并結合其培養特征，菌QJ1、QJ4、QJ6和QJ8分別屬于伯克霍爾德菌、短小桿菌、拉恩氏菌、新鞘氨醇單胞菌，而菌株QJ5、QJ7和QJ10均屬于假單胞菌屬。此外，在本研究中菌株QJ2、QJ3和QJ9的16s rDNA序列與GenBank中已報道序列一致性低于97%，這顯示出麻花秦艽內生細菌微生物種群可能存在新的物種資源[22]。

2.3 麻花秦艽可培養內生真菌分離鑒定

從麻花秦艽的不同組織中共分離到內生真菌3株（QJ11～QJ13），其形態特征見表6。

表5 麻花秦艽可培養內生菌測序比對結果Table5 Result of blast by Genbank of culturable endophyes in Gentiana straminea Maxim

圖1 麻花秦艽內生細菌的系統發育分析Fig.1 Phylogenetic tree of the endophytic banterium of Gentiana straminea Maxim

表6 麻花秦艽可培養內生真菌形態與培養特征Table6 Morphological and cultured characteristics of Culturable endophytic fungus in Gentiana straminea Maxim

對菌株QJ11～QJ13進行ITS基因測序，并在GenBank中進行同源性比對，結果見表5，菌株QJ11與花斑曲霉（Aspergillus versicolor，登錄號LC105686.1）的同源性達99%，構建系統發育樹（圖2），二者位于同一系統發育分支上。綜合同源性比對結果和QJ11與花斑曲霉在發育樹系統中的位置，并結合形態特征，菌株QJ11應屬于花斑曲霉。菌株QJ12與梅花狀青霉（Penicillium herquei，登錄號JN246042.1）的序列同源性達97%，構建系統發育樹（圖2）后，二者位于同一系統發育分支上。菌株QJ13與不可培養真菌（uncultured fungus，登錄號KM233157.1）的同源性最大，達98%，同時與花斑曲霉（Aspergillus versicolor，登錄號 LC105684.1）的序列同源性也達97%，構建系統發育樹（圖2）后，三者位于同一系統發育分支上。

圖2 麻花秦艽內生真菌系統發育分析Fig.2 Phylogenetic tree of the endophytic fungus of Gentiana straminea Maxim

2.4 麻花秦艽可培養內生菌在各組織部位中的分布

從麻花秦艽中共分離純化得到10株細菌和3株真菌。初步鑒定，內生真菌有2個屬、細菌有8個屬，它們在各組織部位的分布見表7。麻花秦艽根、莖、葉和花中含有不同種類和數量的內生菌。麻花秦艽莖中內生菌分離得到7屬，葉部分離得到7屬，根部分離得到8屬，花部分離得到3屬。其中，根中的內生菌種類最多，而花中的內生菌種類最少。菌株QJ2在不同組織部位中均有發現且數量最多，為麻花秦艽內生菌中的優勢屬，其包括的數量所占比例為59.9%。菌株QJ11是真菌中占內生菌總數量比例最高的屬，其包括的數量所占比例為86.7%。其余菌株QJ7和QJ9僅在莖中分離得到，菌株QJ10僅在根中分離得到，菌株QJ12僅在葉中分離得到，菌株QJ11和QJ13僅在根中分離得到。

對不同組織部位分離出的內生菌數量進行分析可知，在麻花秦艽根中以菌株QJ2和QJ5為優勢屬，其所包括數量分別占該組織部位內生細菌總數的81.3%和6.2%，在麻花秦艽莖中以QJ2和QJ3為優勢屬，占該組織部位內生細菌總數的46.0%和36.3%，在麻花秦艽葉中以QJ2和QJ3為優勢屬，占該組織部位內生細菌總數的42.9%和22.0%，在麻花秦艽花中以QJ2和QJ3為優勢屬，占該組織部位內生細菌總數的41.9%和36.3%。

表7 麻花秦艽可培養內生菌在各組織部位中的分布(±s)Table7 Distribution of endophytes in Gentiana straminea Maxim at the different parts(±s) cfu/g

表7 麻花秦艽可培養內生菌在各組織部位中的分布(±s)Table7 Distribution of endophytes in Gentiana straminea Maxim at the different parts(±s) cfu/g

菌株葉莖根Q J 1(1.33±0.58)×10 4 00(6.33±4.16)×10 3(3.41±2.01)×10 5 Q J 2(8.90±0.85)×10 4(1.18±0.75)×10 3 Q J 3(1.67±0.58)×10 4(4.57±2.21)×10 4(9.30±1.13)×10 2(1.53±0.28)×10 4 Q J 4(1.77±0.35)×10 4(1.30±0.61)×10 4(1.40±0.61)×10 4(2.83±1.46)×10 2(2.60±0.62)×10 4 Q J 50(3.67±1.15)×10 4 0(0.71±0.23)×10 2 Q J 6(9.67±1.17)×10 3(8.67±1.53)×10 3 0 Q J 70 0(0.20±0.10)×10 2 0 Q J 8(0.19±0.04)×10 2 0(4.43±2.50)×10 3(0.92±0.45)×10 4 Q J 9(0.62±0.15)×10 2 00 Q J 10(1.90±0.66)×10 3 00 0(8.00±3.46)×10 3 Q J 11 00 0 Q J 12 00 00(0.10±0.09)×10 2(1.20±0.79)×10 3 Q I 13 00 0花0

3 結語

近年來關于秦艽內生菌的報道較少，并且主要集中在從秦艽組織中分離純化一些代謝產龍膽苦苷的微生物菌株。比如：趙強[13]從秦艽的根中分離得到1株產龍膽苦苷的內生真菌根霉QJ18，對QJ18的發酵條件進行優化，篩選出較優的碳源、氮源、溫度和pH條件。徐婉如[30]對產龍膽苦苷的秦艽內生真菌進行誘變育種，篩選得到的突變株QJ18-UV-23和QJ18-H-25的龍膽苦苷產量分別是未突變菌株的1.362倍和1.148倍。此外，曾憲軍等[15]從麻花秦艽中分離得到了1株產龍膽苦苷的內生真菌腐皮鐮刀菌Gj-01，通過發酵培養后積累龍膽苦苷的量為4.13 mg/L。另一方面，內生菌的分布規律可能與宿主本身的特性及內生菌的種類相關，因此在宿主的不同器官中具有不同的分布和結構[31]。在其他藥用植物中的研究表明不同組織部位中內生菌多樣性存在差異[32-33]，比如：對西洋參內生菌多樣性研究結果顯示西洋參根部的內生菌種類最多，為13屬26種，而葉中內生菌最少，僅為9屬16種。南藥植株高良姜不同組織中內生細菌多樣性指數存在顯著差異，以根莖最低，葉最高[34]。但是，目前尚沒有從不同組織部位去研究秦艽內生菌結構的相關報道。本研究從根、莖、葉、花中共得到細菌10株，經鑒定歸屬于2門8屬；真菌3株，歸屬于2屬。其中莖部分離得到7屬，葉部分離得到7屬，根部分離得到9屬，花部分離得到3屬。實驗結果探明了麻花秦艽可培養內生菌在其不同組織部位的分布規律。

同時，藥用植物活性成分生物合成與植物內生菌的分布有緊密聯系，而內生菌群也同樣受植物體內活性成分的影響，兩者之間存在顯著相關性[34-35]。通過研究麻花秦艽可培養內生菌及其優勢菌株的數量與龍膽苦苷含量之間的相關性，弄清了可培養內生菌結構與麻花秦艽有效成分龍膽苦苷之間的相關關系。不僅內生細菌和內生真菌數量分別與麻花秦艽植株中龍膽苦苷的含量成極顯著正相關（P＜0.01）， 而且 優 勢 內 生 菌 QJ2、QJ6、QJ10、QJ11 和QJ13的數量也分別與麻花秦艽植株中龍膽苦苷的含量成極顯著正相關（P＜0.01，表7）。根據已有研究報道，內生菌對植物活性成分的產生和積累途徑的影響主要有兩種方式：一是內生菌能產生外源性誘導子，能快速、專一和選擇性地誘導藥用植物代謝過程中特定基因的表達，調控藥用植物活性成分的生物合成[36]；二是由于具有相同活性產物合成途徑的相關基因或者在共同生活環境中直接接觸而傳遞遺傳物質[37-38]。易培養、生長速度快、生長周期短的自身合成藥用植物活性成分的微生物的研究和開發有希望成為解決秦艽資源緊缺和合理開發利用秦艽資源的有效途徑之一[15]。本課題組在后續研究中發現細菌QJ3和QJ9的發酵液對大腸桿菌、志賀菌和沙門菌均具有較強的抑制作用，化合物的分離純化及鑒定工作在進一步研究中，以期獲得較高活性或者新的化合物。

目前，關于內生菌對藥用植物活性成分的影響仍處在初步探索階段，相關的研究將為內生菌對藥用植物活性成分積累的調控作用提供實踐基礎。因此，本研究通過對麻花秦艽不同組織部位中進行可培養內生菌的分離與鑒定，為麻花秦艽內生菌資源進行進一步的開發奠定了良好的基礎。通過研究麻花秦艽內生菌與其活性成分之間的相關性，有助于深入認識藥材活性成分的形成。同時也為藥用植物活性成分的生產管理奠定理論和實踐基礎，如在秦艽的栽培管理中，接種合適的菌肥和提高其內生菌總數量對秦艽活性物質含量的提高將有積極的促進作用。