抑郁誘導過程中腹腔注射CORM－2大鼠的抑郁癥狀、海馬神經元活性、腦組織炎性因子基因表達觀察

李曉云，孫靜，張軍玲

(益都中心醫院，濰坊261000)

抑郁癥是臨床常見的精神類疾病，主要臨床特征為情緒低落，常伴有思維及行為方面的改變［1]。近年抑郁癥發病率逐年升高，已成為自殺的主要原因［2]。目前，抑郁癥的發生機制尚未完全清楚，30%～40%患者在多種抗抑郁藥物聯合治療下臨床癥狀仍未緩解［3]。研究［4]發現，長期的慢性應激在抑郁癥的發生發展中發揮重要作用。另有研究［5]認為，神經炎癥反應與抑郁癥的進展密切相關。一氧化碳(CO)是一種重要的氣體信號分子，在調控血管張力、細胞生長、抗凋亡、抗炎中發揮關鍵性作用［6]。CO是否能改善抑郁癥患者的抑郁癥狀?目前相關報道較少。為此我們通過慢性應激對大鼠進行大鼠抑郁誘導，觀察抑郁誘導過程中腹腔注射CORM－2誘導大鼠的抑郁癥狀、海馬神經元活性劑腦組織炎性因子白細胞介素1β(IL－1β)、IL－6、IL－8、腫瘤壞死因子－α(TNF－α)的表達變化，并探討其可能作用機制。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 SPF級健康雄性SD大鼠48只，購自山東眾山生物科技有限公司［動物質量合格證號：SCXK(魯)2012－0004]，體質量(200±20)g，飼養于標準條件下，自由飲水和進食。CORM－2購自美國Sigma公司，總RNA提取試劑盒(Trizol法)購自美國Invitrogen公司，逆轉錄和PCR試劑盒購自大連寶生物公司，白細胞介素－1β(IL－1β)、IL－6、IL－8、腫瘤壞死因子 －α(TNF－α)及內參引物均由上海生工生物公司設計合成，尼氏染色液購自北京雷根公司，實時熒光定量PCR儀購自美國Bio－Rad公司。

1.2 大鼠分組、抑郁誘導及CORM－2注射方法取48只大鼠，隨機分為CO干預組、生理鹽水組、誘導組、正常組，每組12只。CO干預組、生理鹽水組、誘導組對大鼠進行抑郁誘導：將大鼠單只單籠飼養，每天被迫進行禁食、45°籠傾斜、冰水游泳、束縛活動、45℃熱水游泳、晝夜倒置、濕籠等刺激中的1～2種，第2天選擇另外兩種刺激，以免相同刺激連續出現，防止大鼠能見刺激的發生，連續刺激21 d。CO干預組在誘導前1天腹腔注射CORM－2 10 mg/kg，后每7天腹腔注射1次，至誘導第21天共注射3次。生理鹽水組在誘導前1天腹腔注射等量生理鹽水，7 d/次，共注射3次。正常組大鼠飼養于正常標準條件下不作任何處理。誘導后正常組12只、誘導組9只、生理鹽水組10只、CO干預組11只。

1.3 各組大鼠抑郁癥狀觀察

1.3.1 各組大鼠體質量、食量和飲水量觀察 分別于誘導前、誘導第21天，于清晨8∶00取各組大鼠進行稱重，記錄各組大鼠體質量、食量和飲水量。

1.3.2 各組大鼠行為能力觀察 ①采用糖水偏好實驗評估各組大鼠快感缺失程度誘導第21天取各組大鼠，檢測前所有大鼠禁飲禁食20 h，于夜間8∶00～10∶00時將大鼠單籠置于無光照環境中，分別給予提前稱重的正常飲用水和1%蔗糖水，自由飲用，30 min時將兩瓶水位置顛倒，60 min后對兩瓶水再次稱重，測算各組大鼠糖水偏好率。糖水偏好率=1%蔗糖水飲用量/(1%蔗糖水飲用量+正常飲用水飲用量)×100%［7]。②曠場實驗誘導第21天取各組大鼠，取無蓋黑底方木箱(100 cm×100 cm×50 cm)，將箱底刷寬約3 mm白線縱橫各3條，形成等大的16個方格，將大鼠朝墻方向放入4個拐角方格之一，讓其自由活動3 min。分別記錄跨越格數(水平活動)和后肢站立次數(垂直活動)［8]。

1.4 各組大鼠海馬組織CA1區神經元活力觀察誘導第21天時在進行完行為學檢測后，各組隨機選取5只大鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，斷頭取腦組織，快速置于－20℃冰箱中15 min，取出后行冠狀位冰凍切片，厚度約2 mm，根據試劑盒說明進行尼氏染色，于高倍顯微鏡下觀察各組大鼠海馬組織神經元形態，取大鼠海馬CA1區染色圖像，利用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件測算大鼠海馬CA1區神經元存活率。海馬CA1區神經元存活率=存活正常神經元數/總神經元數×100%。

1.5 各組大鼠腦組織炎癥因子白細胞介素1β(IL－1β)、IL－6、IL－8、腫瘤壞死因子 α(TNF －α)mRNA檢測 采用實時熒光定量PCR法。誘導第21天時取各組剩余大鼠，斷頭處死后留取腦組織(包括海馬組織)，研磨后加入細胞裂解液，用總RNA提取試劑盒提取細胞中總RNA，利用紫外分光光度計檢測總RNA純度，以A260/A280≥1.80作為合格標準完成后續實驗。將總RNA逆轉錄為cDNA，以模板單鏈cDNA為模板進行PCR。PCR引物序列為 IL－1β上游引物5’－TGACCTGTTCTTTGAGGCTGAC－3’，下游引物 5’－CGAGATGCTGCTGTGAGATTTG－3’;IL－6上游引物 5’－GTACTCCAGAAGACCAGAGG－3’，下游引物 5’－TGCTGGTGACAACCACGGCC－3’;IL－8上游引物5’－TTGGCAGCCTTCCTGATTTC －3’，下游引物5’－TGGTCCACTCTCAATCACTCTCA－3’;TNF－α上游引物5’－TTGACCTCAGCGCTGAGTTG －3’，下游引物5’－CCTGTAGCCCACGTCGTAGC－3’;β－actin上游引物5’－TGCTGTGTTCCCATCTATCG－3’，下游引物5’－TTGGTGACAATACCGTGTTCA－3’。PCR反應條件：95℃ 3 min，95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，73℃ 30 s，連續進行38次循環，每個樣品均設3個平行反應復孔。以2－ΔΔCt代表各組大鼠腦組織IL－1β、IL－6、IL－8、TNF－α mRNA的相對表達量。重復3次，取平均值。

1.6 統計學方法 采用SPSS 21.0統計軟件。計量資料以±s表示，同組大鼠干預前后比較采用配對t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD－t檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠體質量、食量和飲水量比較 誘導前、誘導第21天各組大鼠體質量、食量和飲水量比較見表1。

表1 誘導前、誘導第21天各組大鼠體質量、食量和飲水量比較(±s)

表1 誘導前、誘導第21天各組大鼠體質量、食量和飲水量比較(±s)

注：與誘導前比較，aP＜0.05;與正常組比較，bP＜0.05;與誘導組比較，cP＜0.05;與生理鹽水組比較，dP＜0.05。

組別 n 體質量(g) 食量(g) 飲水量(mL)CO干預組11誘導前 207.9 ±15.1 24.3 ±3.1 28.3 ±3.0誘導第21 天 310.7 ±16.6abcd 29.7 ±3.6abcd 36.1 ±3.6abcd誘導組 9誘導前 205.8 ±11.1 24.5 ±2.0 29.7 ±4.5誘導第21 天 237.1 ±14.9ab 19.9 ±4.1ab 25.2 ±2.3ab生理鹽水組 10誘導前 209.0 ±14.0 24.8 ±3.7 31.8 ±4.0誘導第21 天 245.7 ±15.0ab 23.8 ±4.8ab 25.4 ±1.9ab正常組 12誘導前 207.1 ±14.7 23.8 ±3.4 30.3 ±4.8誘導第21 天 333.8 ±25.1a 34.5 ±4.5a 41.5 ±7.0a

2.2 各組大鼠糖水偏好率、水平活動及垂直活動情況比較 各組大鼠糖水偏好率、水平活動及垂直活動情況比較見表2。

2.3 各組大鼠海馬組織CA1區神經元存活率比較正常組大鼠海馬CA1區神經元胞膜完整、體積大、呈梭形，尼氏體豐富可見;誘導組和生理鹽水組較正常組神經元細胞數量明顯減少，受損細胞增多，胞質減少、胞核固縮、染色淺，尼氏體減少或消失;而CO干預組大鼠正常神經元細胞數較誘導組和生理鹽水組顯著增多，尼氏體增多。CO干預組、生理鹽水組、誘導組及正常組大鼠海馬組織CA1區神經元存活率分別為 61.7% ±9.0%、50.8% ±9.3%、50.4% ±8.2%、72.1% ±12.1%，與正常組比較，誘導組、生理鹽水組和CO干預組海馬組織CA1區神經元存活率降低(P均＜0.05)，與誘導組、生理鹽水組比較，CO干預組海馬組織CA1區神經元存活率升高(P均＜0.05)。

表2 各組大鼠糖水偏好率、水平活動及垂直活動情況比較(±s)

表2 各組大鼠糖水偏好率、水平活動及垂直活動情況比較(±s)

注：與正常組比較，bP＜0.05;與誘導組比較，cP＜0.05;與生理鹽水組比較，dP＜0.05。

組別 n 糖水偏好率(%)水平活動(格數)垂直活動(次)CO 干預組 11 73.2 ± 7.4bcd 49.4 ± 7.4bcd10.2 ±4.2bcd生理鹽水組 10 59.2 ± 8.3b 34.6 ± 7.0b 5.6 ±2.7b誘導組 9 60.2 ±13.9b 30.6 ± 6.3b 3.8 ±3.3b正常組12 92.1 ± 5.6 60.4 ±13.0 15.4 ±4.6

2.4 各組大鼠腦組織 IL －1β、IL －6、IL －8、TNF －α mRNA相對表達量比較 各組大鼠腦組織IL－1β、IL－6、IL－8、TNF－α mRNA相對表達量比較見表3。

表3 各組大鼠腦組織IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α mRNA相對表達量比較(±s)

表3 各組大鼠腦組織IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α mRNA相對表達量比較(±s)

注：與正常組比較，bP＜0.05;與誘導組比較，cP＜0.05;與生理鹽水組比較，dP＜0.05。

組別 n IL－1β mRNA IL－6 mRNA IL－8 mRNATNF－αmRN 11 1.56 ±0.21 1.45 ±0.16 1.39 ±0.14 1.60 ±0.17生理鹽水組 10 1.99 ±0.34 1.82 ±0.26 1.67 ±0.16 1.87 ±0.22誘導組 9 1.95 ±0.31 1.79 ±0.23 1.69 ±0.17 1.85 ±0.21正常組A CO干預組12 1.28 ±0.25 1.12 ±0.18 1.08 ±0.13 1.31 ±0.19

3 討論

抑郁癥作為嚴重威脅人類健康的精神疾病，給患者自身、家庭和社會帶來嚴重危害。研究［9]發現，慢性應激在抑郁發生、進展中發揮重要作用，若個體長期接受不良應激，會導致基礎代謝率升高、出現炎癥反應，并伴免疫力降低、內分泌紊亂及情感行為異常等。因此，目前在研究抑郁時多基于此而制備不可預知應激刺激大鼠誘導，在一定程度上可模擬抑郁癥患者發病過程和精神狀態［10]。本研究利用溫和、多變、不可預知的慢性刺激制備大鼠抑郁抑郁誘導，在刺激第21天時，與誘導前相比，誘導組大鼠體質量、食量和飲水量較建模前發生改變，且體質量、食量和飲水量均較正常組降低，同時，糖水偏好率、水平活動格數和垂直活動次數等行為學評價結果均出現異常，這些結果說明慢性應激可能引起了大鼠抑郁發生及進展，提示成功構建了大鼠抑郁誘導。

細胞因子假說作為抑郁發病機制的重要假說，認為細胞因子與抑郁發病關系密切，前炎性細胞因子如IL－1β、IL－6、IL－8、TNF－α 等參與了抑郁癥的發病［11]。CO作為與一氧化氮類似的具有生物學活性的氣體信號分子，在細胞生長、改善循環、抗凋亡、抗炎等過程中發揮重要重要［12]，可通過減少炎癥反應而減少膿毒癥所致的多器官損傷［13]。CORM－2作為CO攜帶者，在一定環境下能夠可控性的釋放CO而發揮生物學功能［14]。本研究利用腹腔注射CORM－2對抑郁誘導大鼠進行干預，結果顯示，與誘導組和生理鹽水組相比，CO干預組大鼠體質量、食量和飲水量均增加，糖水偏好率、水平活動格數和垂直活動次數等行為學均有所改善，說明外源性給予CO可減少抑郁誘導大鼠抑郁癥狀，腦組織病理學觀察顯示，CO干預組大鼠正常神經元細胞數較誘導組和生理鹽水組顯著增多，尼氏體增多，且神經元存活率增加，進一步說明外源性給予CO可減輕神經元損傷，促使尼氏體恢復，從而改善和保護腦功能。進一步對腦組織中炎癥因子檢測發現，與誘導組和生理鹽水組相比，CO干預組大鼠腦組織中 IL－1β、IL－6、IL－8、TNF－α mRNA 相對表達量均降低，說明外源性給予CO可能通過減輕腦組織炎癥反應而減輕抑郁癥狀，改善腦功能。我們推測，CORM－2具有抗抑郁作用，可能通過減少大鼠海馬組織神經元損傷，降低腦組織IL－1β、IL－6、IL－8、TNF－α mRNA表達等途徑改善抑郁誘導大鼠的抑郁癥狀。

有臨床研究［15]發現，抑郁癥患者外周血中TNF－a、IL－1、IL－6等細胞因子表達水平升高，動物實驗中，外周或中樞給予細胞因子或炎癥誘導劑也可引發動物抑郁樣行為，且可被抗抑郁藥物所阻斷，而將細胞因子阻斷則可產生抗抑郁作用［16]。本文實驗結果進一步證實了抑郁癥發病機制的細胞因子學說，同時間接外源性給予CO可抑制炎癥因子釋放，抗細胞因子治療可能成為抗抑郁藥物的機制之一，將有助于推進抗抑郁藥物作用靶點研究，為抗抑郁治療找到新的干預途徑，目前仍然存在局限性，需繼續大規模實驗證實。

綜上所述，抑郁誘導過程中腹腔注射CORM－2誘導大鼠的抑郁癥狀改善，海馬組織CA1區神經元活力更高，腦組織炎性因子表達降低。CORM－2可通過減少大鼠海馬組織神經元損傷，降低腦組織IL－1β、IL－6、IL－8、TNF－α mRNA 表達等途徑改善抑郁誘導大鼠的抑郁癥狀。