預先給予白藜蘆醇苷對TGF－β1誘導生長小鼠腎足細胞株MPC5增殖的影響及其機制

謝志娟，戴新貴，張平，陳建英

(1南華大學附屬第一醫院，湖南衡陽421001;2湖南省人民醫院)

足細胞定位于腎小球基底膜上，對腎小球結構和功能的維持具有重要作用。足細胞的損傷與機械剪切力、凋亡、細胞器氧化應激、炎癥因子等因素密切相關。在對足細胞損傷機制的大量研究［1～3]中，復合免疫蛋白NOD樣受體熱蛋白結構域3(NLRP3)炎癥小體是位于細胞內的一種蛋白質復合體，可可通過介導氧化應激、炎癥、細胞凋亡、長鏈非編碼RNA信號通路等途徑參與調控足細胞的損傷。近年研究［4，5]證實，微小 RNA － 21(miR － 21)介導的信號通路在調控細胞增殖、凋亡與氧化應激中發揮重要作用，也是生物代謝通路的關鍵靶點。miR－21介導的NLRP3炎癥小體活化信號通路可促進肺纖維化的發生、發展［6]。miR－21介導的信號通路是否通過促進NLRP3炎癥小體的活化介導足細胞損傷?白藜蘆醇苷是一種天然多酚類化合體，具有拮抗氧化應激、炎癥、凋亡信號軸的功效［7]。研究［8]證實，白藜蘆醇苷可通過介導長鏈非編碼RNA MALAT1信號通路調控炎癥介質拮抗動脈粥樣硬化。本課題組前期研究［9，10]也證實，白藜蘆醇可通過介導miR－21/MAPK/AP－1軸信號通路調控炎癥、氧化應激反應，發揮抗肺纖維化的作用。但目前關于白藜蘆醇苷對小鼠腎足細胞株MPC5細胞增殖的影響及其相關機制尚不明確，我們推測白藜蘆醇苷可能通過調控miR－21介導的信號通路對TGF－β1誘導MPC5的增殖效應與NLRP3炎癥小體活化的表達之間有潛在的關聯。為此2018年1～10月，我們觀察了預先給予白藜蘆醇苷對TGF－β1誘導生長小鼠腎足細胞株MPC5增殖的影響，并探討其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、藥物、儀器及試劑 MPC5(購自中科院細胞庫)，10%FBS的 DMEM培養基，放置在37℃ (5℅CO2)細胞培養箱中培養。白藜蘆醇苷(純度約99%)購自西安天一生物技術有限公司。細胞培養箱(Cell Signalin，USA)，冷凍高速離心機及臺式冷凍離心機(德國公司生產);超凈工作臺(蘇信凈化設備廠);DMEM培養(Sigma－Aldrich，USA);胎牛血清(20%FBS，Gibco，USA);miR －21抑制劑 NSC －211332、TGF－β1(Sigma，USA);SOD及MDA檢測試劑盒、二辛可寧酸(BCA)法蛋白質定量試劑盒(Sigma，USA);miR －21、NLRP3、caspase－1及IL－1β等兔多克隆抗體(Santa Cruz，USA);2'，7'－二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH－DA)(Sigma，USA);MTT法細胞增殖檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.2 MPC5 細胞分組及白藜蘆醇苷、TGF －β1、NSC－211332給予方法 取對數生長期MPC5細胞，分為 A、B、C、D 組四組，每組6 個復孔，A、B、C 分別加入 100 μmol/L 白藜蘆醇苷預處理 24 h［8，9]。預處理后A組細胞加入100 μmol/L白藜蘆醇苷培養2 h，再加入10 ng/mL TGF－β1培養24 h;B組加入30 μmol/L的 NSC－211332培養 6 h，再加入 100 μmol/L白藜蘆醇苷培養2 h，再加入10 ng/mL TGF－β1培養24 h;C組加入10 ng/mL TGF－β1培養24 h;D組為空白對照，加入普通培養基。

1.3 各組細胞增殖情況觀察 采用MTT法。培養結束時取對數生長期各組細胞，接種于6孔培養板中，加入20 μL的MTT溶液(5g/L)，置于恒溫箱孵育恒溫(37℃)過夜。加入100 μL的DMSO低頻振蕩10 min，采用酶標儀檢測避光下各組570 nm處的光密度(OD)值。以OD值代表細胞的增殖能力。實驗重復3次，取平均值。

1.4 各組細胞氧化應激指標檢測 取各組細胞，96孔板中，PBS潤洗前后各2次，細胞洗后先加入DCFH－DA，避光37℃孵育約15 min后再次潤洗。采用2'，7'－二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFHDA)負載法檢各組細胞活性氧簇(ROS);采用硫代巴比妥酸法檢測細胞丙二醛(MDA)，WST－1法檢測細胞超氧化物歧化酶(SOD)，所有操作均嚴格按試劑盒說明書進行。重復3次，取平均值。

1.5 各組細胞miR－21及NLRP3、caspase－1及IL－1β蛋白檢測 采用Western Blotting法。caspase－1取各組細胞，充分裂解細胞提取80 μg蛋白，BCA法測蛋白濃度，提取等量蛋白質進行電泳(SDS－PAGE)，采用硝酸纖維素(PVDF)電轉膜;5%脫脂牛奶封閉1 h，分別加入miR－21、NLRP3、caspase－1及IL－1β一抗4℃孵育過夜，β－Tubulin作為內參;次日用磷酸鹽緩沖液洗膜，加二抗在室溫下孵育1h。然后用顯色(化學發光法)，采集圖像(UVP型凝膠圖像分析系統)，Image J軟件分析目的條帶的積分光密度值，以代表目的蛋白相對表達量。重復3次，取平均值。

1.6 統計學方法 采用SPSS18.0統計軟件進行處理。計量資料以±s表示，兩組比較采用t檢驗，多組數據比較采用F檢驗或單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞OD值比較 A、B、C、D組細胞OD值分別為14.73 ±1.60、12.70 ±1.13、19.31 ±1.79、12.62±1.26，與 D 組比較，C 組細胞 OD 值升高(P＜0.05);與 C組比較，A組細胞 OD值降低(P＜0.05);與 B組比較 A組細胞 OD值升高(P＜0.05)。

2.2 各組細胞MDA、ROS、SOD相對表達量比較各組細胞MDA、ROS、SOD相對表達量比較見表1。

表1 各組細胞MDA、SOD、ROS相對表達量比較( ×103，±s)

表1 各組細胞MDA、SOD、ROS相對表達量比較( ×103，±s)

注：與D組比較，aP＜0.05;與 C組比較，bP＜0.05;與 A 組比較，cP＜0.05。

組別 MDA(nmol/mg) SOD(μ/mg) ROS(AU)A 組 17.73 ±2.08b 202.37 ± 9.15b 1 500.79 ±45.66b B 組 13.44 ±1.20c 217.45 ± 9.77c 812.55 ±40.17c C 組 21.10 ±2.13a 128.46 ± 8.12a 2 118.44 ±50.19a D組12.26 ±1.17 280.33 ±10.19 788.62 ±35.10

2.3 各組 MPC5細胞 miR －21、NLRP3、caspase－1及IL－1β蛋白相對表達量比較 各組MPC5細胞miR－21及、NLRP3、caspase－1及IL－1β蛋白相對表達量比較見表2。

表2 各組MPC5細胞miR-21及NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白相對表達量比較(±s)

表2 各組MPC5細胞miR-21及NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白相對表達量比較(±s)

注：與D組比較，aP＜0.05;與 C組比較，bP＜0.05;與 A 組比較，cP＜0.05。

組別 miR－21 NLRP3 caspase－1 IL－1β A 組 1.33 ±0.11b 0.21 ±0.02b 0.31 ±0.09b 0.93 ±0.17b B 組 0.99 ±0.03c 0.15 ±0.03c 0.18 ±0.08c 0.72 ±0.07c C 組 4.10 ±0.53a 1.16 ±0.12a 1.04 ±0.19a 1.81 ±0.18a D組1.16 ±0.07 0.12 ±0.02 0.06 ±0.01 0.24 ±0.06

3 討論

足細胞參與穩定腎小球毛細血管，維持腎小球濾過屏障的功能，在糖尿病腎病的發生、發展中扮演重要的角色［3，11]。目前，NLRP3 炎癥小體活化及非編碼RNA介導足細胞損傷的發病機制已成為研究的熱點。NLRP3炎癥小體由NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白和caspase－1組成［12]。激活的NLRP3招募caspase－1并介導自身寡聚體化誘導活化caspase－1促IL－1β誘發機體炎癥反應爆發性釋放，同時免疫細胞的激活誘導免疫應答失衡與腎小球足細胞的氧化應激和凋亡緊密相關［13]。研究［13，14]報道，ROS誘導NLRP3炎癥小體活化信號通路在糖尿病腎病的發病機制中發揮重要作用。miR－21可介導TGF－β1調控NLRP3/IL－1β/NOX4信號通路促肝纖維化［15]。因此，本研究進一步探討miR－21是否激活ROS－NLRP3炎癥小體系統，破壞氧化還原水平穩態，促進細胞增殖導致MPC5細胞的損傷。據此，可推測miR－21可介導TGF－β1誘導NLRP3炎癥小體活化信號通路參與細胞增殖及氧化應激。本研究將miR－21抑制劑NSC－211332預處理TGF－β1孵育的 MPC5，以探討 miR－21/TGF－β1/NLRP3信號軸對MPC5細胞增殖及氧化應激的影響。結果顯示，C組細胞中SOD含量進一步明顯下降，MDA、ROS含量及細胞增殖OD值顯著升高，也明顯促進 miR－21、NLRP3、caspase－1及IL－1β 蛋白的表達。本研究結果也表明，B、C組各指標變化均相反。由此可推測，miR－21可通過介導ROS－NLRP3炎癥小體－TGF－β1信號軸影響氧化還原水平的穩態，誘導氧化應激反應及啟動細胞凋亡增殖。因此，靶向沉默關鍵位點miR－21基因后對TGF－β1誘導MPC5細胞的損傷具有保護作用。

白藜蘆醇苷是一種藥效學多樣化的多酚類化合物，是SIRT3的有效抑制劑，具有影響細胞生長周期、參與miRNA誘導線粒體—凋亡的通路、調控內質網應激－自噬途徑等多重生物效應［16]。研究［17]發現，白藜蘆醇可介導miR－21/STAT3信號通路抑制調節性T細胞改變腫瘤微環境抗肝癌作用;白藜蘆醇苷靶向調控miR－21的下游靶基因SIRT1的表達減少ox－LDL誘導細胞內活性氧生成、抑制炎癥因子表達及提高抗巨噬細胞增殖的能力［18];白藜蘆醇可介導SphK1/AP－1信號通路抑制腎小球系膜細胞增殖［19]。與此同時，本課題組前期研究表明：白藜蘆醇通過阻礙細胞周期進展及促進細胞凋亡途徑抑制人胚肺成纖維細胞細胞增殖［20];白藜蘆醇介導TGF－β1/ADAMTS－1信號通路抑制肺組織炎癥反應，并且降解膠原蛋白從而抑制肺纖維化的作用［21]。鑒于白藜蘆醇廣泛的生物學效應及調控腎小球上皮細胞的病理過程，我們推測白藜蘆醇可能參與了對miR－21下游靶基因及miR－21介導TGF－β1誘導NLRP3炎癥小體活化信號通路參與細胞增殖及氧化應激的調控。本研究結果發現，白藜蘆醇苷干預后，能抑制MPC5細胞增殖，同時抑制miR－21、NLRP3、caspase－1及 IL－1β 等蛋白的表達和ROS、MDA的表達。此外，運用miR－21通路抑制劑NSC－211332阻斷miR－21表達，發現白藜蘆醇苷抗氧化、協同性抗NLRP3炎癥小體活化因子表達的效應加強，且NLRP3表達再次明顯下降，進一步證實miR－21通路在TGF－β1誘導MPC5細胞增殖中的作用，同時推測miR－21/NLRP3炎癥小體通路介導MPC5細胞增殖造成腎細胞損傷的重要機制。以上結果顯示：我們可預測白藜蘆醇苷下調miR－21表達調控MPC5細胞氧化應激水平的穩態及抑制NLRP3炎癥小體活化的表達起到減輕細胞損傷的作用，但具體分子機制仍需進一步研究探討及研究。本研究為基于白藜蘆醇苷治療MPC5細胞損傷的靶向治療方案提供體內初步的實驗證據，同時為下一步體外實驗相關信號通路奠定了實驗基礎。

綜上所述，TGF－β1可促進MPC5細胞增殖，白藜蘆醇苷可抑制TGF－β1誘導的MPC5細胞增殖。其機制可能為下調miR－21表達，增加SOD含量，降低胞內MDA與ROS含量，調控MPC5細胞氧化應激水平的穩態;同時抑制細胞NLRP3、caspase－1及IL－1β蛋白表達，抑制NLRP3炎癥小體的活化，減輕足細胞損傷。