主動脈瓣反流合并左心室增大患者外周血差異表達環狀RNAs的篩選

文智，譚程，吳建強，洪瀾，薛楊，孫小康

(德陽市人民醫院，四川德陽618000)

主動脈瓣關閉不全時，左心室容量負荷加重、室壁張力增加。如心瓣膜關閉不全未能及時糾正，左心室繼續肥厚和擴大，心肌細胞纖維化，心室壁順應性下降，導致左心室功能不可逆性損害［1]。心臟超聲測量中國40～59歲漢族男性左心室舒張末期內徑(LVEDD)正常值為 38.4 ～ 54.5 mm［2]。左心室內徑增大是心臟瓣膜手術的獨立危險因素，也是生存率的獨立預測因子。阻止和逆轉主動脈瓣關閉不全患者的左心室重構是目前的研究熱點，除從外科手術方面解決原發病因著手外，基因調控心肌細胞的重構層面也是一個研究突破口。文獻［3，4]報道，miRNA－233是一種可以誘導心肌肥大的內源性調節子，與心肌重構有關。近年來，隨RNA測序技術的廣泛應用和基因芯片技術的快速發展，研究［5]發現許多前體mRNA可被非線性地反向剪接或通過基因重排而形成反向首尾連接的環狀RNA(circRNA)，circRNA在所有剪接轉錄本中占有較大比例。circRNA可充當miRNA海綿，競爭性抑制miRNA的轉錄調控，有效影響miR靶基因活性，發揮轉錄后調控作用［6]。研究［7]表明，circNRA 不編碼蛋白，卻在表觀遺傳學、轉錄調控及轉錄后調控等中扮演了重要角色，能在基因組水平及染色體水平對基因表達進行調控;有著結構穩定、豐度高、序列保守性高、組織特異性高等特點［8]。Memczak 等［9]通過對外周全血、組織樣本進行 circRNAs檢測后，發現血液樣本中的circRNAs是穩定且易于檢測，全血可作為實驗標本來研究circRNA與特定疾病的關系。

我們采用circRNA微陣列芯片技術分析主動脈瓣反流合并左心室增大患者與主動脈瓣反流患者左心室正常患者外周血circRNA表達譜，初步篩選外周血差異表達circRNAs，并尋找預測靶向吸附miRNA223的差異表達的circRNAs，從而篩選出可能參與調控主動脈瓣反流所致左心室增大的circRNAs，為進一步進行阻止和逆轉主動脈瓣關閉不全患者左心室重構的研究提供初步依據。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年8月～2018年9月德陽市人民醫院心胸外科確診為主動脈瓣反流合并左心室增大的4例患者(觀察組)，均為男性，年齡(51.25 ±6.40)歲，漢族，左心室 LVEDD ＞60 mm;對照組選取同研究期主動脈瓣反流的4例患者，均為男性，年齡(49.5 ±5.26)歲，漢族，左心室 LVEDD 38～55 mm。納入標準：①心臟彩超提示主動脈瓣關閉不全;②超聲測量左心室LVEDD均符合左心室增大的判定標準，其余房室腔測值具有可比性;③符合手術指征且在德陽市人民醫院行單純主動脈瓣置換術：④無高血壓、糖尿病、慢性肝腎病、惡性腫瘤、結締組織病、類風濕疾病;⑤不包括需要手術治療的其他瓣膜器質性病變、先天性心臟病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、擴張性心肌病。本研究經德陽市人民醫院醫院倫理委員會審核通過，標本的采集均經過家屬授權并簽署知情同意書。

1.2 外周血circRNAs檢測

1.2.1 標本采集 兩組均于術前1日用 PAX-gene?全血RNA管采集外周血5 mL，液氮保存送上海康成生物公司進行芯片檢測。

1.2.2 受檢標本總RNA的提取與純化 按照 TRIzol試劑盒(Invitrogen公司，美國)說明，分別提取兩組外周血總RNA，利用Buffer RPE反應體系對總RNA進行提純，使用NanoDropDN－1000分光光度計測定濃度及230、260和280 nm處的光密度OD值，測算 OD260/OD280、OD260/OD230評估純度，采用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳方法檢測RNA完整性。兩組提取總RNA的OD260/OD280均在2.00左右(1.80～2.10)，OD260/OD230均 ＞2.00，說明總 RNA 純度較高，電泳后均得到28S、18S、5S三條界限分明、位置一致的條帶，說明總RNA完整性較好。兩組抽提總RNA符合下一步RNAs基因芯片檢測的實驗要求。

1.2.3 circRNAs檢測 ①cDNA 合成、標記與純化采用RNA核糖核酸酶去除總RNA中的線性RNA，然后采用環狀RNA labeling(Arraystar公司，美國)轉錄和擴增circRNAs成帶有熒光標記的cRNA，并使用RNeasy小型試劑盒(Qiagen公司，德國)純化標記的 cRNA，NanoDropDN－1000測定被標記cRNA濃度和活性。②芯片雜交將標記后的樣品與Human circRNA Array(6×7K)芯片(Arraystar公司，美國)進行排列雜交，然后用Gene Expression Wash Buffer(Agilent公司，美國)進行清洗。③芯片掃描機掃描數據 雜交芯片由Axon GenePix 4000 B(Axon公司，美國)微陣列掃描儀掃描獲得芯片圖，然后將掃描圖像導入GenePixPro6.0軟件(Axon)得到circRNAs原始數據。

1.3 統計學方法 使用R軟件對原始數據進行分位數歸一化，兩組芯片數據經歸一化處理后，cir-cRNA表達分布情況在8組標本中幾乎相同，說明可進行下一步數據分析處理。通過P－value和FDR篩選兩組外周血具有統計學意義的差異表達的circRNAs。兩個樣品間差異表達 circRNAs通過熒光信號強度差異倍數Fold Change(FC)及 P值篩選，差異表達的circRNAs的判定標準為在4例樣本中至少有3例出現，以配對t檢驗P＜0.05，FC值＞2(代表circRNA表達上調或下調)。對芯片篩選出的差異表達circRNA作層次聚類分析，兩組外周血circRNAs的表達水平組內一致性高，數據可用。利用 TargetScan［10]和 miRanda［11]兩個軟件預測差異表達circRNA最可能結合的miRNA，取匹配值較高的5個miRNA，并對這5個miRNA的結合位點進行預測和注釋，分析與心肌重構相關miRNA－233有關聯的circRNAs。

2 結果

觀察組158個circRNA的熒光信號強度FC值均＞2，且與對照組比較，P均＜0.05;其中105個表達下調、53個表達上調，21個circRNAs的FC值＞5。見表1。

表1 觀察組中FC＞5的差異表達circRNAs

158個差異表達 circRNAs中，hsa_circRNA_102898(下調，miR－223－3p/miR－612/miR－127－5p/miR－338－5p/miR－624－5p)、hsa_circRNA_101661(上調，miR－223－3p/miR－875－3p/miR－148b－5p/miR－92a－2－5p/miR －689)、hsa_circRNA_103740(上調，miR－362－5p/miR－223－3p/miR－362－3p/miR－622/miR－212－3p)與miRNA－233存在結合位點。

3 討論

circRNAs廣泛存在于全血、血清、血漿、腦脊液、尿液、精液等體液內［12]。Memczak 等［9]對人類全血中的RNA進行測序，結果顯示百余種circRNAs的表達量明顯高于對應組織的 miRNA。外周血的circRNAs主要存在外泌體中，并以此作為載體在體內運輸，外泌體內的脂質分子可以對circRNAs起保護作用，是其結構保持穩定［13]，而且外泌體可以穿過血腦屏障，所以神經系統病變所釋放的circRNAs也可以在血液中檢測到［14]。Zhao等［15]通過基因芯片分析冠心病患者和健康對照患者血清中的環狀RNA發現前者血清環狀RNA相較于后者有12種上調、10種下調，進一步研究發現冠心病患者血清中明顯上調的hsa_circ_0124644具有最高的靈敏度和特異度，且對冠心病具有更高的診斷價值。Wu等［16]通過芯片分析，發現高血壓患者血漿中的circRNAs相對于對照組表達下調的有13種，表達上調的有46種，has_circ_0005870在高血壓患者血漿中的表達明顯下調，提示其可能是診斷高血壓的一種新型生物標志物。

在由左心室負荷增大引起的心室重構的病理過程中，心肌細胞的總數是恒定的，心肌間質蛋白質合成增加，肌節致密重組，導致心肌細胞重構和心功能下降［17]。Zhou等［18]使用 circRNA 芯片篩查糖尿病db/db小鼠心肌中circRNAs表達譜，發現了24個上調和19個下調的circRNAs。在體外實驗中，發現circRNA_010567顯著上調，生物信息學分預測circRNA_010567可吸附并抑制miR－141的功能，并通過雙熒光素酶法測定驗 功能實驗表明，沉默circRNA_010567的功能可上調miR－141，進而下調TGF－β1表達，并抑制纖維化相關蛋白α－SMA/ColⅠ/ColⅢ的表達。該研究表明，circRNAs通過circRNA－miRNA－mRNA通路在糖尿病小鼠模型心肌纖維化過程中有重要作用。Jakobi等［19]運用二代環狀測序技術和DCC軟件對鼠科動物的心臟組織 circRNAs進行篩選，發現 Dmd－circRNA、Ryr2－circRNA、Ttn－circRNA可能直接或者間接影響相關的心血管疾病如擴張型心肌病、右室心肌病、心肌肥厚等的發生和發展。本研究結果發現，與對照組比較，觀察組共存在158個差異表達circRNAs。158個差異表達的circRNAs中105個表達下調、53個表達上調。158個circRNAs中FC＞5的有21個，表明差異表達的circRNA可能參與了左心室增大病理過程的調控。

miR－233是一種可以誘導心肌肥大的內源性調節子，它可以受多種細胞因子調控，并調控下游的細胞因子，提高心肌細胞內葡萄糖代謝能力，從而促進心肌細胞肥大［4，6，7]。含胱冬肽酶富集功能域的凋亡抑制因子(ARC)是其下游的作用靶點，ARC蛋白是20世紀末發現的在心肌、骨骼肌和大腦等終末分化組織中大量表達的抗凋亡蛋白，在心肌內表達可以起到防止心肌肥大和心肌細胞凋亡的作用。Wang等［20]通過建立的老鼠心衰模型，并發現mm9－circ－012559在心衰老鼠的心臟中含量顯著降低，于是將其稱為心臟相關性環狀 RNA(HRCR)，HRCR可以直接結合 miR－223并充當內源性的miR－233吸附海綿，抑制 miR－223表達、上調ARC表達。因此，可以通過HRCR －miR－233－ARC調控通路，抑制心肌細胞肥大，臨床表現上可起到阻止心臟增大和心力衰竭的作用。在本研究中，發現與miR－233存在結合位點的差異表達的circRNA 有 hsa_circRNA_102898、hsa_circRNA_101661、hsa_circRNA_103740。本研究推測這些circRNA可能通過靶向吸附miRNA－233來調控左心室增大病理過程。

綜上所述，與主動脈瓣反流無左心室增大患者比較，主動脈瓣反流合并左心室增大患者外周血存在158個差異表達 circRNAs，hsa_circRNA_103245、hsa_circRNA_104014、hsa_circRNA_102617、hsa_circRNA_103421等21個circRNAs表達譜有顯著差異。158個circRNAs中105個表達下調、53個表達上調。158個差異表達circRNAs可能與主動脈瓣反流合并左心室增大的發生、發展有關。.hsa_circRNA_102898、hsa_circRNA_101661、hsa_circRNA_103740可能通過與miRNA－233位點結合調控左心室增大。由于本篩選研究納入標本數量較少，有一定的局限性，還需要大樣本的臨床驗證研究、后期做circRNA與miRNA吸附機制研究及PCR擴增驗證來進一步研究加以證實，進一步探討目標circRNA與左心室增大的關系，深入研究目標circRNA參與左心室增大病理過程的作用機制。