生物樣本庫冷凍組織樣本質量評估

倪雅楠，胡穎，王易雪，宋麗潔，陳萌，張連海

(北京大學腫瘤醫院暨北京市腫瘤防治研究所生物樣本庫，惡性腫瘤發病機制及轉化研究教育部重點實驗室，北京100142)

臨床生物樣本庫主要負責收集、儲存、利用和管理人類組織樣本，同時配置相應的數據庫管理系統，為基礎研究人員提供病理類型、腫瘤分期、靶向治療等相關的樣本信息［1，2]。高質量生物樣本是精準醫療研究的重要資源，對臨床探索新的治療手段、新藥研發配置等具有極其重要的作用［3]。生物樣本在應用于科學研究前，需長期保存在生物樣本庫中，樣本質量對于科學研究是否成功起著至關重要的作用，因而標準化、規范化的生物樣本質量控制成為了科學研究成功的保障［4，5]。為保證有效的利用寶貴的人類樣本資源，確保科研結果的可重復性和比較性，因此生物樣本質量控制在生物樣本庫建設中顯得尤為重要。生物樣本質量評估是指從分子水平和病理形態等方面對樣本進行評價，判斷其是否符合生物樣本質量標準［6，7]。為保證能為科學研究提供高質量的生物樣本，需確定快速而準確的評判方法來判斷生物樣本是否達到標準［8]。我們觀察了反復凍融對生物樣本庫中冷凍腫瘤組織樣本RNA、DNA以及組織病理形態的影響，以此來確定有效的冷凍生物樣本質量評估方法，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗樣本、試劑及儀器 隨機選取我院生物樣本庫－80℃低溫冰箱中凍存的腫瘤組織4例，分別為胃、胰腺、肝、結腸腫瘤組織樣本。超低溫冰箱(Thermo 88000 Series)、臺式離心機(Thermo Heraeus Fresco 21)、RNA Screen Tape、RNA Screen Tape樣品緩沖液、RNA Screen Tape Ladder、包埋劑OCT，化學試劑均為分析純。

1.2 腫瘤組織分組及反復凍融處理方法 分別取4份冷凍腫瘤組織，將同一組織標本平均切分為2份，一份為A組，樣本未經凍融，一份為B組，置于冰上完全融化后再次放入－80℃低溫冰箱中，反復凍融3次后備用。

1.3 腫瘤組織RNA的純度、濃度及完整性鑒定取兩組腫瘤組織樣本，TRIzol法抽提兩組樣本RNA，并鑒定其純度、濃度與完整性。提取后的RNA經紫外分光光度計(Nano Drop 2000)檢測純度與濃度，通過OD值(A260/A280=1.9～2.0)判斷 RNA 純度;所提取的總RNA經Agilent 2200分析儀檢測，根據檢測圖像與RNA完整性指數(RNA Integrity Number，RIN)值判定RNA完整性。RNA完整性指數RIN使用10～1反映RNA完整性程度，10為完整性最高，1為降解程度最高［9];RIN≥7視為較高質量的 RNA，可用于基因芯片等的高級別研究［10，11]。

1.4 腫瘤組織DNA純度、濃度及完整性鑒定 取兩組組織樣本，按照天根組織基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA。提取后的DNA經紫外分光光度計檢測純度與濃度，并通過 A260/A280=1.8～1.9判斷DNA純度。DNA樣本經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并根據電泳條帶亮度及有無拖尾判定DNA樣本完整性。

1.5 腫瘤組織樣本病理形態鑒定 取兩組組織樣本，使用冰凍切片機(Thermo NX70)制作冰凍切片，厚度5 μm，低溫保存。HE染色后，通過病理切片掃描儀(Leica Aperio CS2)成像觀察樣本組織形態，并測算腫瘤部分所占比例。按照國際腫瘤基因組協作研究的意見，腫瘤部分≥80%為合格的腫瘤樣本。

1.6 統計學處理方法 使用SPASS20.0統計軟件進行處理。計數資料比較用χ2檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 腫瘤組織RNA完整性鑒定 A組胃、胰腺、肝、結腸腫瘤組織 RNA純度分別為 1.97、1.92、1.95、1.98，RNA 濃度分別為 880.8、853.6、771.9、838.3 ng/μL;B 組胃、胰腺、肝、結腸腫瘤組織 RNA純度分別為 1.32、1.27、1.85、1.31，RNA 濃度分別為20.0、0.72、687.2、13.4 ng/μL。A、B 兩組樣本RNA電泳圖像及RIN值如圖1所示，A組電泳可見清晰的5S、18S、28S 條帶，B 組電泳可見 28S、18S 條帶發生不同程度降解。A、B兩組腫瘤組織RNA純度、濃度間比較，P 均 ＜0.01。

圖1 兩組樣本RNAAgilent 2200圖像及RIN值

2.2 腫瘤組織DNA完整性鑒定 A組胃、胰腺、肝、結腸腫瘤組織 DNA純度分別為 1.83、1.83、1.86、1.87，DNA 濃度分別為 358.2、462.3、431.0、392.2 ng/μL。B 組胃、胰腺、肝、結腸腫瘤組織 DNA純度分別為 1.86、1.82、1.85、1.85，DNA 濃度分別為 288.6、397.0、315.5、440.7 ng/μL。兩組樣本DNA電泳圖像如圖2所示，A組電泳條帶清晰無明顯拖尾，B組電泳條帶略有拖尾。A、B兩組腫瘤組織DNA純度、濃度間比較，P均＞0.05。

圖2 兩組樣本DNA電泳圖像

2.3 腫瘤組織樣本病理形態鑒定 兩組腫瘤組織病理組織形態如圖3所示。A、B兩組樣本腫瘤組織部分所占比例均＞80%，A、B兩組均為合格的腫瘤組織樣本(以上檢測有經驗豐富的病理科技師完成)。

3 討論

樣本質量是生物樣本庫的核心，高質量的生物樣本可為醫學科學研究提供可靠的數據來源，確保后續科研實驗不受樣本質量的影響［13，14]。定期對樣本質量的抽檢可以驗證生物樣本庫樣本收集方式、保存條件及時間對樣本的影響，從而進一步尋找提高樣本質量的方法［15～17]。目前腫瘤冷凍組織樣本是腫瘤轉化研究中最有價值的數據來源，分子水平的研究則需要樣本能夠提供高質量的核酸，因此冷凍樣本的質量則成為了冷凍組織生物樣本庫的核心［16～21]。

圖3 各組腫瘤組織病理組織形態

實驗從DNA、RNA、組織切片病理形態三個方面比較反復凍融后組織樣本分子水平與形態的變化。隨機抽取4例腫瘤生物樣本，將同一組織樣本在低溫下均勻切割為兩部分，其中A組樣本未經凍融，B組樣本反復凍融三次后，同時提取RNA測量濃度、純度，并經Agilent 2200檢測RIN值，結果顯示，A組樣本RNA純度均在標準范圍內(A260/A280=1.9～2.0)，RIN 值均≥7，電泳圖像中可見清晰的5S、18S、28S條帶，說明RNA質量達到合格標。B組樣本中，除肝臟腫瘤組織經反復凍融3次后，組織樣本仍能保持較好的質量，但RIN值有所降低;其余樣本純度OD值＜1.4，RIN值均≤5.6，電泳圖像中28S、18S條帶發生不同程度降解，說明反復凍融三次后組織樣本RNA發生不同程度降解。B組樣本質量明顯低于A組樣本;兩組腫瘤組織RNA濃度、純度間比較差異具有統計學意義，說明RNA質量可以很好的反映織樣本凍融變化過程中樣本質量的變化。同時提取DNA，測量濃度、純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，A組樣本DNA純度在標準范圍內(A260/A280=1.8～1.9)，電泳條帶清晰無明顯拖尾，DNA質量達到合格標準;B組樣品DNA的OD值也在標準范圍內，電泳條帶略有拖尾，DNA質量基本符合標準。說明A、B兩組DNA質量差別不明顯;兩組腫瘤組織DNA濃度、純度間比較差異無統計學意義，說明DNA質量不能很好的反應組織樣本凍融變化過程中樣本質量的變化。與DNA相比，RNA在樣本的收集、處理、存儲過程中更易降解，所以RNA的質量更能夠體現樣本的質量情況，并且可作為衡量樣本核酸質量的標準。

病理切片掃描儀成像下，A、B兩組樣本病理形態未發生明顯變化，說明切片法不能反應反復凍融后樣本質量的變化，但可通過觀察腫瘤細胞含量來判斷取材部位是否準確、是否為合格腫瘤組織樣本。本研究中兩組腫瘤組織含量均達到總組織的80%以上，為合格的腫瘤生物樣本。

影響組織樣本質量的因素是多方面的，如采集流程、樣本離體時間、樣本儲存條件等等。目前樣本庫多為存儲庫，收集的樣本需在深低溫條件下長時間存儲，因此需要建立一套有效、快速的冷凍生物樣本質量評估流程。基因組技術是基因篩查、研究腫瘤等疾病中使用的重要技術之一，而基因組技術則依賴于樣本核酸的質量。本實驗從分子水平出發、評估冷凍組織樣本的質量，以及反復凍融對樣本質量產生的影響。

DNA是相對穩定的分子，RNA在長期儲存過程中會面臨著降解的問題，樣本在出庫過程中需盡量避免核酸、蛋白的降解，出庫過程應盡量在較低溫度下進行，并避免反復凍融。隨著樣本庫存儲樣本逐年增多，我們希望尋找到快速有效的方法來確定冷凍組織樣本的質量。RNA質量鑒定可以很好地反應冷凍組織樣本的質量，通過病理切片觀察腫瘤細胞含量的百分比以此確定取材部位是否準確，兩者相結合可作為目前冷凍樣本質量評估的有效方法之一。樣本的質量對于科學研究能否成功起著至關重要的作用，高質量的生物樣本可為臨床研究提供可靠的數據來源，保證科研結果的有效性、準確性;生物樣本的使用過程也是對樣本進行檢測的過程，因此應收集研究者對于樣本的質量反饋信息、建立樣本質量反饋機制，根據反饋信息改進樣本收集、處理方式等不斷提高樣本質量。

綜上所述，與未經凍融的腫瘤組織比較，反復凍融后腫瘤組織RNA發生不同程度降解，RNA質量降低;DNA質量與腫瘤組織樣本中腫瘤部分含量無明顯差別，但病理切片可判定取材部位是否準確，RNA質量、與病理切片檢測相結合可較好的反應冷凍組織樣本的質量情況。