miR-206、miR-155在乳腺癌中的表達及其與激素受體相關性分析*

覃舒婷，莫軍揚,張敏敏，唐 茜,盧林捷，陳 巖，韋業剛，楊 立

(廣西壯族自治區柳州市人民醫院普外三科 545006)

乳腺癌是一種激素依賴性腫瘤，其相關性激素受體，包括雌激素受體(estrogen receptor,ER)、孕激素受體(progesterone receptor,PR)和Her-2的表達水平，是選擇個體化內分泌治療方案、評估愈后的重要依據。微小RNA(microRNAs，miRNA/miR) 是一種內源性非編碼RNA，具有抑癌基因或類癌基因的功能。最近研究發現，miRNA在乳腺癌的診斷、轉移、愈后、耐藥等多方面起了重要作用[1]。本研究通過實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測乳腺癌組織中miR-206、miR-155的表達，比較其與ER、PR、無病生存期(disease free survival，DFS)的相關性，探討其是否能成為一種新的預測內分泌治療敏感度及患者預后評估的標記物，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年1-12月本院100例女性乳腺癌患者為研究對象，平均年齡(50.08±10.85)歲；所有患者均按WHO乳腺腫瘤分類標準進行病理學分型，TNM分期中Ⅰ期25例，Ⅱ期56例，Ⅲ期19例；無淋巴結轉移48例，有淋巴結轉移52例；病理類型：浸潤性導管癌95例，中分化腺癌1例，小葉癌2例，導管內癌2例。所有患者在采集組織標本前均未經放、化療，且無乳腺炎癥等并發癥。

1.2方法

1.2.1標本采集 收集100例女性乳腺癌組織石蠟標本，重新切片用于免疫組織化學。同時收集術中乳腺組織，取自病變非壞死部位,置于滅菌凍存管，液氮速凍,-80 ℃保存，用于RT-qPCR。

1.2.2試劑與儀器 Hipure FFPE miRNA Kit提取分離試劑盒購自廣州Magen公司，ReverTra Ace ToYoBo qPCR RT Kit反轉錄試劑盒購自上海ToYoBo公司，PCR采用KAPA Probe Fast qPCR Master Mix試劑盒購自北京KAPA公司，RT-qPCR儀(型號Mx3005P)購自上海安捷倫公司。兔抗人ER、PR一抗購自美國Cell Signaling公司，羊抗兔二抗、多聚甲醛、石蠟、檸檬酸緩沖液、蘇木素和伊紅等免疫組織化學試劑購自北京中杉金橋生物技術公司。

1.2.3試驗方法

1.2.3.1免疫組織化學檢測乳腺癌組織ER、RP表達 乳腺癌組織標本進行切片，每張厚度4 μm。烤片、二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水。阻斷內源過氧化物酶：3%H2O2，室溫封閉5～10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3 min，共3次。抗原修復：0.01 mmol/L枸櫞酸緩沖液(pH=6.0)中煮沸15～20 min，冷卻20 min，PBS沖洗3 min，共3次。血清封閉：滴加5% BSA 封閉液，室溫封閉15 min。加一抗：4 ℃過夜，PBS沖洗3 min，共3次。滴加辣根過氧化物酶(HRP)標記抗兔IgG二抗，室溫孵育1 h。PBS沖洗3 min，共3次。DAB顯色，蘇木素復染，常規脫水、透明、干燥，中性樹脂封片，室溫保存。光學顯微鏡下觀察染色結果，每張切片取至少5～8個視野，由兩名副高職稱的病理醫生進行結果判定。ER、PR染色位于乳腺癌細胞的細胞核，其表達強度的不同，可呈淺棕色至深棕色。ER、PR陽性標準為：≥1%腫瘤細胞核陽性。

1.2.3.2miR-206、miR-155水平檢測 取乳腺癌組織，應用Trizol試劑、氯仿、異丙醇、RNA提取分離試劑盒，按照isoTMplus及異丙醇按說明書步驟進行操作，提取總RNA。取2.0 μg 總RNA為模板，加入反轉錄引物合成cDNA。再取cDNA模板，進行PCR擴增，上游引物分別為U6、miR-206、miR-155。U6正向引物：5′-CAC TCA GCT CAC GCA AAT TCG TG-3′；miR-206正向引物：5′-CAC TCA GCT GTG GAA TGT AAG GAA GTG-3′；miR-155正向引物：5′-CAC TCA GCT GTT AAT GCT AAT CGT GAT AG-3′；下游共同引物為miR-27，miR-27反向引物：5′-CTG GTG TCG TGG AGT CG-3′。RT-qPCR條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 3 s，55 ℃ 30 s，讀FAM熒光數值，40個循環；30 ℃ 30 s。以參照基因U6和miR-206、miR-155基因作為標準，利用RT-qPCR通過2-△△Cp方法分析相對基因表達差異，其中△Cp=[Cp(處理組目的基因)-Cp(處理組內參基因)]。U6、miR-206、miR-155的熒光定量標準曲線見圖1～3。

圖1 U6的熒光定量標準曲線

圖3 miR-155的熒光定量標準曲線

1.2.4隨訪 采取門診復查或電話隨訪，隨訪時間截止至2017年12月。失訪10例，90例患者隨訪滿36個月，隨訪率為90%。主要觀察指標為DFS。

2 結果

2.1ER、PR在乳腺癌組織中的表達 100例乳腺癌患者中，ER表達陽性77例，陽性率77%。PR表達陽性66例，陽性率66%，見圖4、5。

A:ER染色陽性；B:ER染色陰性

圖4乳腺癌組織中ER染色結果(免疫組織化學法，×200)

A:PR染色陽性；B:R染色陰性

圖5乳腺癌組織中PR染色結果(免疫組織化學法，×200)

2.2乳腺癌組織中miR-206和ER、PR表達的相關性 乳腺癌組織中miR-206的表達水平與ER表達水平呈負相關(P<0.05)，而miR-206與PR表達無相關性(P>0.05)，見表1。

表1 乳腺癌中miR-206和ER、PR表達相關性

2.3乳腺癌組織中miR-155和ER、PR表達的相關性 乳腺癌組織中miR-155的表達和ER、PR表達均呈負相關(P<0.01)，見表2。

表2 乳腺癌中miR-155和ER、PR表達相關性

圖6 miR-206表達水平與DFS相關性

2.4乳腺癌組織中miR-206、miR-155與DFS相關性 對乳腺癌患者進行36個月的追蹤隨訪，以miR-206相對表達中位值2-△△Ct=-2.12作為截斷值，Kaplan-Meier分析表明，癌組織中miR-206低表達者，無病生存率下降；低表達組平均無病生存時間為33.3(31.9，34.7)個月，高表達組為35.3(34.6，35.9)個月，兩組比較差異有統計學意義(χ2=4.381，P=0.036)。以miR-155相對表達中位值2-△△Ct=-0.94作為截斷值，Kaplan-Meier分析表明，癌組織中miR-155高表達者，DFS率下降；高表達組平均DFS時間為33.7(32.5，34.9)個月，低表達組為35.2(34.4，36.0)個月，兩組比較差異有統計學意義(χ2=4.894，P=0.027)，見圖6、7。

圖7 miR-155表達水平與DFS相關性

3 討論

目前，無論在國內或是國外，乳腺癌都是女性發病率最高的惡性腫瘤，術后有效的內分泌治療和愈后評估對患者尤為重要。乳腺癌是一種激素依賴型腫瘤，雌激素和孕激素已證實與乳腺癌的發生、發展和轉移密切相關。臨床上，多依據癌組織ER、PR、Her-2的表達情況，來制訂內分泌治療方案及評估預后[2-3]。

miRNA是一種內源性非編碼RNA，經基因芯片分析，部分miRNA具有激素應答功能[4]。最近研究發現，miRNA通過類癌基因或抑癌基因的方式參與了乳腺腫瘤細胞的生長發育及信號轉導[5]，因此，miRNA可能與乳腺癌相關受體有一定的相關性，本研究通過分析miRNA與ER、PR、DFS的相關性，因而可認為其能成為一種新的預測內分泌治療敏感度及評估預后的標記物。

miR-206是最早發現的與乳腺癌相關的miRNA。miR-206對癌細胞ER的表達可能起負調控作用。ADAMS等[6]發現miR-206可與ER mRNA 3′端的結合位點結合，導致ER數量下調。將miR-206轉染入乳腺癌MCF-7細胞系中，癌細胞ER表達下調[7]。YIN等[8]培養ER陽性的乳腺癌細胞后發現，miR-206可通過轉化生長因子-β(TGF-β)通路抑制上皮-間質細胞的轉化。本研究結果亦顯示miR-206在乳腺癌組織中的表達與ER的表達呈負相關，而與PR無相關性，可能與miR-206的作用機制有關。多項研究發現，miR-206主要通過下調ER及ER共調節蛋白mRNA、蛋白表達[9]，或直接作用于Notch3、Cdc42等蛋白，從而抑制癌細胞增殖、轉移，未經過PR及相關作用途徑。miR-155是最早被發現的具有促癌活性的miRNA，有研究發現：miR-155在ER、PR陰性的乳腺癌組織中的表達水平明顯高于ER、PR陽性患者，在三陰性或Her-2型乳腺癌組織中高表達。且血清或癌組織miR-155能早期預測ER、PR狀態，以協助判斷臨床乳腺癌的分子分型[10-11]。本研究結果顯示，miR-155在乳腺癌組織中的表達與ER、PR的表達均呈負相關。

既往研究發現，miR-206通過TWF1/MKL1-SRF/IL11信號通路抑制乳腺癌細胞增殖和遷移[12]。而miR-155可促進腫瘤的侵襲轉移，從而產生負性預后效應[1]。本研究結果也發現，miR-206和患者DFS呈正相關，miR-155與DFS呈負相關。可見，二者對疾病的預后評估也存在潛在價值。

綜上所述，乳腺癌組織中miR-206、miR-155的表達與ER、PR、DFS均有相關性，其可成為新的預測內分泌治療敏感度及患者預后評估的標記物。下一步可增加樣本量驗證，探索miRNA在乳腺癌早期診斷、腫瘤轉移侵襲、內分泌方案選擇及預后等多方面的價值。