黃芪桂枝五物湯減少鉑蓄積預防奧沙利鉑慢性外周神經毒性機制研究＊

魏國利，顧展丞，李靈常，馬 駿，陳 晨，錢 峻，霍介格＊＊

（1.南京中醫藥大學附屬中西醫結合醫院 南京 210028；2.江蘇省海門中醫院 海門 226100；3.江蘇省淮安市中醫院 淮安 223001；4.江蘇省鹽城市中醫院 鹽城 224002；5.南京中醫藥大學中醫學院/中西醫結合學院 南京 210023）

奧沙利鉑（oxaliplatin，OXA）作為新一代鉑類抗腫瘤藥物，是多種消化系統腫瘤化療的一線推薦用藥。慢性外周神經毒性是限制其作用發揮的最主要原因，常導致藥物劑量的使用不足甚至化療中止，影響療效[1]。奧沙利鉑致慢性外周神經毒性（Oxaliplatininduced chronic peripheral neuropathy, OICPN）主要表現為手足末梢麻木、疼痛及感覺異常，符合中醫“痹癥”范疇[2]。臨床中發現黃芪桂枝五物湯可以預防奧沙利鉑慢性外周神經毒性[3]。近來研究發現鉑蓄積在奧沙利鉑慢性外周神經毒性（OICPN）的發病機制中扮演重要角色[4]。本研究通過建立奧沙利鉑慢性神經毒性大鼠模型，觀察黃芪桂枝五物湯對鉑蓄積的影響，探討黃芪桂枝五物湯預防奧沙利鉑慢性外周神經毒性可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

健康雄性Wistar 大鼠45只（上海斯萊克實驗動物中心），SPF 級，體重180-220 g。動物飼養于安靜、通風和空氣過濾系統的環境中，保持室溫20-25℃，相對濕度40% -60% ，自由進食和飲水。為保持動物晝夜生物節律，實驗室每日8：00至20：00開燈，20：00至次日8：00 熄燈。本實驗嚴格按照國際疼痛學會（IASP）關于應用清醒動物進行疼痛實驗研究綱要的要求實施和完成。

1.1.2 實驗藥物

生黃芪、桂枝、炒白芍、大棗、生姜均由江蘇省中醫藥研究中藥房提供。黃芪桂枝五物湯（生黃芪18 g、桂枝9 g、炒白芍9 g、大棗9 g、生姜9 g）成人處方生藥量54 g（前期多次實驗結果表明高劑量中藥組療效最佳，故本實驗中藥組只設高劑量組，2.48g·mL-1），加入10倍量的水煎煮，后濃縮至各劑量所需的體積，4℃保存備用。奧沙利鉑（艾恒）注射液，50 mg，批號：12071012，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，5% 葡萄糖注射液100 mL：5 g，批號：2012051801，氯化鈉注射液100 mL：0.9，批號：12012091203。

1.1.3 主要實驗儀器和試劑

疼痛觸覺測試套件（Von frey hairs）購自美國Stoelting公司）普通PCR儀和ABI7500型熒光定量PCR儀購自Applied Biosystems，電感耦合等離子體發射質譜儀ICP-MS 2000（江蘇天瑞儀器）,電鏡全波長酶標儀購自Thermo Scientific；尼氏染色液購自Beyotime，RTPCR試劑盒、q-PCR試劑盒購自Thermo Scientific，PCR引物購自Genscript。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥

將45 只健康雄性Wistar 大鼠適應性喂養1 周后，稱重，隨機分為空白組、奧沙利鉑模型組、黃芪桂枝五物湯組，每組15 只。黃芪桂枝五物湯組灌胃給藥10 mL·kg-1，每日1 次，空白組、奧沙利鉑模型組予0.9% NaCl溶液灌胃（10 mL·kg-1），每日1次。奧沙利鉑用藥當天，中藥于奧沙利鉑應用前1 h給藥。

1.2.2 奧沙利鉑慢性神經毒性模型建立

參照Mihara Y 等[6]的造模方法，將奧沙利鉑50 mg溶于25 mL的5% 葡萄糖溶液中，終濃度為4 mg·mL-1，（2 mL·kg-1）現配現用。除空白組第予以腹腔注射5% 葡萄糖注射液2 mL·kg-1外，其余4 組按照4 mg·kg-1，2 mL·kg-1予以腹腔注射奧沙利鉑。一周2 次，共4 周（d1，2，8，9，15，16，22，23）。

1.2.3 指標檢測

（1）體重：第0、7、14、21、28 d測量大鼠體重。

（2）機械性縮足反射閾值：第0、7、14、21、28 d通過Von Frey試驗檢測大鼠機械性縮足反射閾值。檢測方法：將一個塑料盒子（20×15×20 cm）放到一個金屬篩網上，在測試之前先讓大鼠適應5 min。選取折力1-15 g Von Frey纖維細絲垂直刺激大鼠后肢足底中間的部分，持續時間為6 s。測定時首先從折力2.0 g 開始，當該力度的刺激不能引起陽性反應時，則給予相鄰大一級力度的刺激；若出現陽性反應則給予相鄰小一級力度的刺激。每個折力的Von Frey纖維細絲均連續測定5次，每次刺激間隔30 s，5次當中有3次或3次以上的陽性反應視為有機械痛敏，最大力度為15 g，大于此值時記為15 g。大鼠機械縮足閾值持續下降表示神經毒性的產生。

（3）坐骨神經HE染色：造模第28 d，每組選擇3只大鼠，腹腔注射10% 水合氯醛（3 mL·kg-1）麻醉后仰臥固定，注入100 mL PBS，后注入100 mL 4% 的多聚甲醛固定，分離大鼠雙側坐骨神經（從上端開始大概取長度為0.5 cm），將坐骨神經投入預先配好的4% 多聚甲醛固定液中使組織固定。后脫水透明石蠟包埋，切白片HE染色液染色后用中性樹膠封片，普通光鏡觀察測量核仁大小。

（4）背根神經節（Dorsal root ganglion,DRG）尼氏染色：造模第28 d，每組選擇3 只大鼠，腹腔注射10% 水合氯醛（3 mL·kg-1）麻醉后仰臥固定，注入100 mL PBS，后注入100 mL 4% 的多聚甲醛固定，分離L4-5 DRG，將DRG 投入預先配好的4% 多聚甲醛固定液中使組織固定。后脫水透明石蠟包埋，切白片尼氏染色液染色后用中性樹膠封片，普通光鏡觀察測量核仁大小。

（5）背根神經節電鏡：造模第28 d，每組選擇1 只大鼠，麻醉固定，心臟灌注PBS溶液后分離L4-5 DRG，將DRG 切割成0.5-1 mm 的小塊，先后給予2.5% 的戊二醛、1% 鋨酸中固定后包埋、修片，醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛染色，電鏡觀察細胞微細結構病理改變。

圖1 大鼠機體重變化

圖2 大鼠機械性縮足閾值變化

圖3 大鼠坐骨神經HE染色（1000 X）

（6）背根神經節鉑蓄積：造模第28 d，每組選擇3只大鼠，麻醉固定，心臟灌注PBS 溶液后分離L4-5 DRG，-80℃保存。檢測時給予硝酸消解，再次稀釋后采用ICP-MS法檢測細胞內鉑含量。

（7）qPCR 檢測背根神經節OCT2、ATP7A 基因表達：造模第28 d，每組選擇3只大鼠，麻醉固定，DRG分離同上，-80℃保存。檢測時將標本放入加有1mlTRIZOL的EP管中，在勻漿機上勻漿后加入試劑提取總RNA，1ugRNA 用于cDNA 第一鏈的合成，PCR 引物序列如下：OCT2-F：5'-CAG AGG AGC TGA ACT ACA CCG T-3'，OCT2-R：5'-ACA GTG GGT CCA CAC AGT CA-3'；ATP7A-F：5'-TAG ACG GCA TGC ATT GTA AAT C-3'，ATP7A-R：5'-TGG ATT TTA CAC CTG GCT TCT T-3'；內 參GAPDH-F：5'-TGG TCT ACA TGT TCC AGT ATG ACT-3',內參GAPDH-R：5'-CCA TTT GAT GTT AGC GGG ATC TC-3'。RT-PCR:

反應條件25℃5 min，42℃30 min，85℃5 min，反應停止后測cDNA 濃度，稀釋10 倍用。qPCR:反應體系：2*SYBR 10 μL ，引物F 1 μL ，引物R 1 μL ，cDNA 2 μL，Water 6 μL，離心進樣檢測計算RQ值。

1.2.4 統計學方法

采用SPSS17.0 統計軟件包進行數據統計學分析，多組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05表示具有統計學意義，P<0.01表示具有顯著性統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠體重變化

與空白組相比，隨著奧沙利鉑的應用，模型組大鼠開始出現體重下降，第21 d 出現統計學差異（P<0.05），第28 d（P< 0.01）。而黃芪桂枝五物湯不能改善奧沙利鉑導致的體重下降（P>0.05）（圖1）。

2.2 各組大鼠不同時間機械性縮足閾值變化

與空白組相比，造模第14 d 模型組大鼠開始出現機械性縮足閾值下降（P<0.05）。第21、28 d模型組機械性縮足閾值下降更為明顯（P<0.01），而黃芪桂枝五物湯高劑量組未出現明顯的機械閾值下降（P>0.05）（圖2）。

2.3 各組大鼠坐骨神經病理形態變化

圖4 大鼠背神經節光鏡油鏡圖片1000X

圖5 大鼠背根神經節電鏡2.5K

圖6 大鼠背根神經節鉑含量

HE染色后光鏡下觀察坐骨神經（圖3），與空白組（A）相比，多次腹腔注射奧沙利鉑后，模型組（B：奧沙利鉑）大鼠坐骨神經神經纖維排列紊亂。黃芪桂枝五物湯組（C：奧沙利鉑+黃芪桂枝五物湯2.48 g·mL-1）神經纖維排列輕度紊亂。

2.4 各組大鼠背根神經節細胞核仁大小變化

尼氏染色后光鏡下觀察背根神經節（圖4），與空白組（A）相比，多次腹腔注射奧沙利鉑后，大鼠背根神經節細胞胞質淡然，核仁縮小（黑色箭頭指示），模型組（B：奧沙利鉑）核仁縮小最明顯。黃芪桂枝五物湯組（C：奧沙利鉑+黃芪桂枝五物湯2.48 g·mL-1）核仁大小變化輕。

2.5 各組大鼠背根神經節線粒體變化

電鏡下觀察（圖5），與空白組（A）相比，多次腹腔注射奧沙利鉑后大鼠背根神經節細胞的線粒體（紅色箭頭指示）出現腫脹，部分嵴斷裂和空泡形成，模型組（B：奧沙利鉑）線粒體損傷最明顯。黃芪桂枝五物湯組（C：奧沙利鉑+黃芪桂枝五物湯2.48 g·mL-1）線粒體有腫脹但無空泡形成。

2.6 各組大鼠背根神經節鉑含量

ICP-MS 法定量檢測背根神經節內的鉑含量（圖6），與空白組相比，多次腹腔注射奧沙利鉑后大鼠背根神經節細胞內鉑含量增加，與慢性外周神經毒性的程度呈正相關，模型組鉑含量顯著高于空白組（P<0.01），中藥組的鉑含量均明顯低于模型組（P<0.05）。

2.7 背根神經節鉑蓄積相關因子OCT2、ATP7A 基因表達

qPCR 結果顯示（圖7），與空白組相比，模型組大鼠背根神經節細胞OCT2mRNA表達量增加（P<0.05），ATP7AmRNA 表達量無變化（P> 0.05），與模型組相比，黃芪桂枝五物湯組OCT2 mRNA和ATP7AmRNA的表達量均下降（P<0.05）。

3 討論

圖7 大鼠背根神經節OCT2和ATP7A mRNA表達比較

奧沙利鉑是臨床中廣泛應用的化療藥物，其與氟尿嘧啶組成的化療方案被國內外各大指南一致推薦為結直腸癌術后輔助化療的標準方案。外周神經毒性限制了其臨床應用，奧沙利鉑引起的外周神經毒性分為急性和慢性兩種，急性神經毒性常發生在奧沙利鉑用藥后1 周內，一般癥狀輕微可自行恢復[5]；慢性外周神經毒性是其劑量限制性毒性，一般在應用奧沙利鉑2周期以后逐漸出現，隨著奧沙利鉑累積劑量的增加而加重，4-6周期化療結束后發生率高達42.1-69% ，臨床表現為四肢末端的麻木、疼痛可伴有精細運動障礙，部分患者停藥后癥狀仍可持續數月甚至數年嚴重影響了患者的生活質量[6-8]。雖然已開展了多種藥物防治奧沙利鉑外周神經毒性的臨床研究，如鈣鎂合劑、還原型谷胱甘肽、卡馬西平、文拉法辛、維生素E、B 族維生素等[9]。但是到目前為止沒有任何一種藥物被證實可以有效的防治奧沙利鉑引起的慢性外周神經毒性。

研究表明鉑蓄積是奧沙利鉑慢性外周神經毒性產生的重要機制，背根神經節（DRG）是奧沙利鉑慢性外周神經毒性主要的傷害靶器官，奧沙利鉑進入機體后會優先蓄積在背根神經節內[10]。文獻報道，OCT2 和ATP7A 是鉑蓄積的關鍵因子，鉑類藥物進入機體后，背根神經節細胞通過OCT2 將藥物轉運至細胞內，通過ATP7A將藥物泵出細胞外，二者失衡后導致了鉑蓄積，鉑蓄積會激活氧化應激、線粒體損傷等，引起DRG神經元細胞損傷，導致DRG 功能異常，產生外周神經毒性[11,12]。體外實驗發現給予奧沙利鉑處理，過表達OCT2 的HEK293 細胞株鉑含量是正常細胞株的28.6倍，體內實驗也發現抑制OCT2 的表達可以減少奧沙利鉑神經毒性的發生[13]。研究同時也發現絕大多數腫瘤不表達或極少表達OCT2，體內外實驗也證實抑制OCT2 的功能，不影響鉑類藥物的抗腫瘤作用[14,15]。Virginia 等也實驗證實ATP7A 表達增加可以促進奧沙利鉑流出細胞從而減少其對神經元DNA 損傷的結果[16]。

OICPN 主要表現為手足末梢麻木、疼痛及感覺異常伴或不伴有精細運動障礙，屬于祖國醫學“痹證”的范疇。《內經·痹論》“其不痛不仁者，病久入深，榮衛之行澀，經絡時疏，故不痛，皮膚不營，故為不仁”。腫瘤患者本身存在正氣不足，化療藥物屬于有毒傷正之品，應用奧沙利鉑后會進一步損傷機體正氣，導致氣血不足，營衛虛弱，氣虛則推動無力血行澀滯，血虛則榮養不足，最終四肢末梢經絡閉阻不通，筋脈失養，不通、不榮則出現四肢末梢疼痛、麻木等癥狀。基于此，我們認為OICPN 的中醫病機為氣血不足，營衛虛弱，經絡閉阻。黃芪桂枝五物湯出自張仲景的《金匱要略》，是治療“痹證”的經典名方，黃芪桂枝五物湯對OICPN預防作用已有大量的文獻報道[17,18]。前期我們開展的小樣本隨機對照臨床研究（NCT02590367），結果顯示黃芪桂枝五物湯可以預防OICPN 的發生且不影響奧沙利鉑的抗腫瘤療效[19]。

在本實驗中我們建立了OICPN 動物模型，結果顯示黃芪桂枝五物湯可以拮抗奧沙利鉑引起的機械性縮足閾值的下降，預防OICPN 發生。進一步的實驗結果也證實黃芪桂枝五物湯可以減少鉑蓄積及鉑蓄積導致的下游細胞損傷如核仁縮小、線粒體腫脹等。qPCR的結果提示黃芪桂枝五物湯可能是通過下調OCT2表達、上調ATP7A表達，減少背根神經節細胞鉑蓄積的。本研究首次從鉑蓄積的角度研究中藥復方黃芪桂枝五物湯預防奧沙利鉑慢性外周神經毒性發生的機制，為臨床中的應用提供了依據。但黃芪桂枝五物湯如何調控OCT2h和ATP7A表達尚不清楚，值得進一步研究。