探索進展型EAE 小鼠中樞神經系統不同部位的組織病理學和小膠質細胞的動態變化＊

鄧永琦，羅 會，郭晴晴，呂愛平，何小鵑，耿 耘

（1.西南交通大學生命科學與工程學院 成都 610031；2.中國中醫科學院中醫臨床基礎醫學研究所北京 100700；3.香港浸會大學中醫藥學院 香港 999077）

多發性硬化（multiple sclerosis，MS）是中樞神經系統（central nervous system，CNS）慢性疾病，主要由異常的自身免疫反應引起；炎癥反應、髓鞘脫失和神經膠質增生為MS 的主要病理特征[1,2]。小膠質細胞是中樞神經系統的先天免疫細胞之一，具有抗原呈遞，病原體和壞死組織吞噬，細胞因子分泌的作用[3,4]。小膠質細胞的極化和MS 的病情發展關系密切，M1 型方向極化可使病情加重，M2型方向極化有助于恢復病情[5]。但是，目前小膠質細胞在MS 病變不同部位不同時間點的極化情況尚不明確，CNS 的病變過程也缺乏動態研究。因此，為進一步了解MS病程中的病理學變化，本實驗使用C57 BL/6 小鼠建立進展型EAE 模型。對小鼠病程進展不同時間點的CNS 各部位進行檢測，觀察髓鞘脫失、炎細胞浸潤的改變，以及M1 型、M2 型小膠質細胞數量的動態變化。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

1.1.1 實驗動物

50 只10-12 周齡的雌性C57BL/6 小鼠，購自維通利華實驗技術有限公司[動物許可證號：SCXK(京)2016-0011]，于中國中醫科學院動物房[動物許可證號：SYXK(京)2016-0021]飼養，溫度：20-25℃，相對濕度：40% -60% 。

1.1.2 試劑

完全弗氏佐劑（complete Freund's adjuvant，CFA），購自美國Chondrex公司；多肽凍干粉MOG35-55（H-Met-Glu-Val-Gly-Trp-Tyr-Arg-Ser-Pro-Phe-Ser-Arg-Val-Val-His-Leu-Tyr-Arg-Asn-Gly-Lys-OH）,購自上海強耀生物科技有限公司；百日咳毒素（PTX），購自美國List Biological Laboratories 公司；Mayer 染液，HE 染色液，Luxol Fast Blue 髓鞘染色液，購自北京索萊寶科技有限公司；iNOS 抗體，購自英國Abcam 公司；Arg-1抗體，免疫組化二抗（HRP,Rabbit），DAB顯色試劑盒，購自美國Cell Signaling Technology 公司；TRNzol 試劑盒購自天根生化科技有限公司；Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，SYBR?Premix Ex TaqTM購自日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 EAE造模與分組

將CFA 和400 mg·mL-1的MOG35-55多肽緩沖液以1∶1體積用量，制成抗原乳劑。于Day 0日在每只麻醉后的小鼠上腹部皮下注射乳劑0.2 mL；在Day 0、Day 2日均腹腔注射PTX 200 ng，以誘導小鼠進展型EAE 模型[6]。據病程發展，將小鼠分為正常組、S1 組（發病點）、S2組（發病初期）、S3組（發病高峰期）和S4組（慢性持續期）5個組，并依次于Day 0、Day 14、Day 18、Day 24、Day 42取材。

1.2.2 臨床評分

Day 0起每日觀察小鼠狀態，每兩日評分一次。臨床評分標準[6]為沒有癥狀，記為0分；尾部張力降低，記為1 分；中度后肢無力，記為2 分；共濟失調或后肢癱瘓，記為3分；四肢完全癱瘓，記為4分；垂死狀態或死亡，記為5 分。發病情況處于中間情況的則以±0.5 分計，分高于0.5即被認為發病。

1.2.3 取材

小鼠處死后取出完整大腦、腦干和脊柱，脊柱分別取頸段、胸段和腰段，剖出脊髓。組織固定于10% 中性甲醛48 h，中性磷酸鹽緩沖液沖洗后常規脫水操作，石蠟包埋制成蠟塊切片，厚度5μm，每20μm取一張，放入烤片機60℃烤干備用。

1.2.4 LFB 染色

每只小鼠取5 張切片常規脫蠟，以95% 乙醇溶液醇化后用LFB 染液覆蓋組織，4℃孵育過夜；染色后將切片分別用95% 乙醇和純水清洗，然后依次置于分化液、70% 乙醇中至著色情況良好，將切片脫水透明后封片。顯微鏡下拍片觀察，以盲評法對髓鞘脫失情況評分[7]。評分標準：無脫失，計為0 分；罕見病灶，計為1分；幾個脫髓鞘的區域，計為2分；大面積脫髓鞘，計為3分。

表1 引物序列

1.2.5 HE染色

分別取每只小鼠各部位5 張切片，置于二甲苯及梯度乙醇中脫蠟，用蘇木素覆蓋組織染色10 min，用純水洗滌后，將組織用鹽酸乙醇分化，然后置于1% 伊紅中復染15 min，純水洗滌后于梯度乙醇脫水，二甲苯透明后用中性樹膠封片。在顯微鏡下拍攝組織以觀察炎癥，并通過盲評對組織炎癥進行評分[8]。評分標準：無炎癥細胞，計為0 分；少數分散的炎性細胞，計為1分；血管四周炎癥浸潤，計為2分；在灰質區，出現不完全炎性浸潤或血管“袖套樣”浸潤，計為3分。

1.2.6 IHC檢測

IHC檢測方法參照以下步驟進行：烘烤切片后，脫蠟并水化，以檸檬酸緩沖液為介質，采用高壓修復抗原；依次以3% H2O2溶液、3% BSA 溶液避光封閉1 h；再用稀釋好的一抗（iNOS，1∶1000；Arg-1，1∶1000）4℃反應過夜，孵育二抗；用DAB 顯色，蘇木素復染；常規脫水透明后中性樹膠封片。用“Image-Pro Plus 6.0”軟件對顯微鏡200×鏡頭下所攝圖像處理，對每平方毫米的陽性細胞數量進行分析。

1.2.7 Real-Time PCR檢測

RNA 提取照TRNzol 試劑盒說明書進行操作。測定總RNA濃度后，按反轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄合成cDNA。調整濃度后以cDNA為模板，配置PCR反應體系，以內參β-actin作為對照，引物序列（表1）。反應條件為：首先熱變性，95℃30 s；擴增40 個循環，95℃5 s，60℃退火10 s；溶解條件，95℃15 s，60 ℃1 min，95℃5 s。

圖1 進展型EAE小鼠臨床評分

1.3 統計學分析

用SPSS 18.0 軟件對數據進行統計分析。數據表示為平均值± 標準差，采用單向Anova 分析組間差異。認為P<0.05差異具有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 臨床評分

臨床評分結果（圖1），EAE 小鼠于造模后第14 天開始發病，于Day 24到達高峰期，隨后病情稍有好轉，進入慢性持續期，臨床評分維持在3分左右。

2.2 LFB染色結果

LFB染色結果顯示正常小鼠脊髓白質均勻呈深藍色，白質與灰質的界限清晰可見；在模型組中，脊髓白質區域染色不均，出現白斑區域，髓鞘脫失（圖2）。隨著疾病的發展，小鼠脊髓不同部位的髓鞘脫落逐漸嚴重；同時期以腰髓段的髓鞘脫失最嚴重。

2.3 HE染色結果

圖2 進展型EAE小鼠不同時間點CNS不同部位髓鞘染色結果（50×）

圖3 進展型EAE小鼠不同時間點CNS不同部位HE染色結果（50×）

HE染色結果顯示，正常組小鼠CNS各部位著色均勻，組織排列正常，無炎細胞浸潤；在各模型組中，炎細胞出現，并逐漸滲透至血管周圍，甚至灰質部位出現血管“袖套樣”浸潤（圖3）。在進展型EAE 的發病過程中，小鼠CNS 各部位炎細胞浸潤均于發病點出現，隨疾病進展逐漸加重，于慢性持續期趨于穩定。同一時期不同發病部位的炎細胞浸潤程度略有差異，相對于大腦和腦干，脊髓部位的炎細胞浸潤更為嚴重。

2.4 M1 型小膠質細胞變化

以iNOS 特異性標記小鼠CNS 中M1 型小膠質細胞。IHC 結果顯示，正常組小鼠CNS 各部位有少量的M1型小膠質細胞；模型組小鼠CNS各部位均發現大量M1 型小膠質細胞浸潤。在EAE 發病后的四個時間點，M1型小膠質細胞數量逐漸增加；相對大腦和腦干，脊髓部位的M1 型小膠質細胞數量更多，其中以腰髓段最多（圖4）。

2.5 M2型小膠質細胞變化

以Arg-1 特異性標記小鼠CNS 中M2 型小膠質細胞。IHC 結果顯示，在EAE 模型小鼠的發病過程中，CNS各部位的M2型小膠質細胞數量先增加后減少，它在發病高峰時達到最大值，并在慢性持續時間內顯著下降。從病變部位來看，脊髓中M2 型小膠質細胞數量比多于大腦、腦干部位；在脊髓不同部位中，腰髓段M2型小膠質細胞數量最多（圖5）。

圖4 進展型EAE小鼠M1型小膠質細胞IHC結果（200×）

2.6 Real-Time PCR結果

腰髓部位M1 型和M2 型小膠質細胞標志蛋白iNOS、Arg-1以及相關炎癥因子TNF-α、IL-4的轉錄水平（圖6）。相對正常組小鼠，iNOS，TNF-α的mRNA 水平隨病程進展逐漸增加；Arg-1，IL-4 的mRNA 水平相對正常小鼠則呈現先增加后降低的趨勢，于發病高峰期出現最大值，在慢性持續期略有下降。

3 討論

圖5 進展型EAE小鼠M2型小膠質細胞IHC結果（200×）

常用的EAE 模型有多種，而MOG35-55多肽誘導C57BL/6小鼠建立的模型因病理特點與進展型多發性硬化最為相似，故成為臨床最常用的模型[9]。成功建立該模型與免疫方法密切相關，而乳劑制備與免疫部位的選擇至關重要。配制乳劑時先加入CFA 再逐滴加入MOG35-55多肽緩沖液，更易乳化充分；而免疫部位通常有后肢足掌、尾部和側腹部，注射部位的不同對臨床病程、高峰期、最高臨床評分等影響不同，據實驗經驗，選擇上腹部皮下注射能更好地模擬進展型多發性硬化的發病過程。

本實驗研究了小鼠CNS 不同部位在疾病發展中組織病理學變化和M1、M2 型小膠質細胞數量的動態變化。結果顯示隨疾病進展，髓鞘脫落和炎細胞浸潤持續惡化，腰髓段的髓鞘脫落更為嚴重，而脊髓部位的炎細胞浸潤更嚴重。小膠質細胞作為CNS 內常駐的免疫細胞，受到刺激后，細胞表型發生改變，并增殖聚集在病灶部位，分泌多種細胞因子[10]。M1型小膠質細胞，能特異性表達iNOS 蛋白，產生TNF-α，IFN-γ等促炎因子，發生神經毒性反應；M2型小膠質細胞，能特異性表達Arg-1蛋白，產生抗炎因子如IL-4和TNF-β，發揮神經保護作用[11-13]。實驗結果顯示，隨病情發展M1型小膠質細胞的浸潤增加，而M2 型的浸潤先增加后減少，兩者均在腰髓段浸潤最多。

圖6 進展型EAE小鼠各組腰髓Real-Time PCR結果圖

當前對MOG35-55誘導的進展型EAE 模型的研究，多集中在模型建立的方法及影響因素、發病部位的病理變化以及相關免疫細胞在病程中的動態變化[14-16]。通過本實驗，可對該模型CNS 不同部位組織病理學的動態變化和兩種表型的小膠質細胞在各發病階段的激活過程有更清楚的了解，可作為進一步研究進展型MS的病理機制的基礎依據，以期對藥物篩選以及療效評價提供參考。同時，由于MS 發病機制尚未完全清楚，其病變過程又與免疫反應、炎癥反應以及神經毒性反應等各方面均有密切關系，使得本實驗對該模型的全面認識存在一定局限性，但這也成為了今后繼續研究的方向。