固相萃取-液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定土鱉蟲(chóng)中12 種真菌毒素＊

余詩(shī)琪，汪 波，呂 盼，聶 晶＊＊

（1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 武漢 430065；2.湖北省藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院 武漢 430075）

土鱉蟲(chóng)（Eupolyphaga Steleophaga）為鱉蠊科昆蟲(chóng)地鱉Eupolyphaga sinensis或冀地鱉Steleophaga plancyi的雌蟲(chóng)干燥體[1]，有溶血栓、抗凝血、抗腫瘤、促進(jìn)骨折愈合、調(diào)節(jié)血脂、耐缺氧、抗突變等作用[2]，主要用于治療跌打損傷、骨折筋傷、血瘀經(jīng)閉等證[3]。在我國(guó)河北、山東、河南、山西、湖北等省均有出產(chǎn)[4]。作為動(dòng)物類中藥，土鱉蟲(chóng)在加工、運(yùn)輸、貯藏過(guò)程中易發(fā)霉，沾染真菌[5]，其真菌產(chǎn)生的真菌毒素對(duì)人體及動(dòng)物具有毒害作用，關(guān)于動(dòng)物藥材易污染真菌的問(wèn)題目前已得到廣泛關(guān)注[6]，如羅朝權(quán)等[7]對(duì)6 種動(dòng)物類藥材中黃曲霉毒素進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)土鱉蟲(chóng)的污染率高達(dá)33.3% 。土鱉蟲(chóng)類動(dòng)物藥材基質(zhì)復(fù)雜，極可能被各種不同的真菌污染并產(chǎn)生不同類型的真菌毒素，但有關(guān)土鱉蟲(chóng)中其他種類的真菌毒素檢測(cè)的報(bào)道較少。真菌毒素是一類天然產(chǎn)生的生物毒素[8,9]，目前已發(fā)現(xiàn)包括黃曲霉毒素類、伏馬毒素類、赭曲霉毒素等300 多種真菌毒素[10]，大多數(shù)真菌毒素都具有致癌、致畸和致突變的毒性作用[11]，其共同毒性主要是致DNA 損傷和細(xì)胞毒性，低濃度下即可對(duì)人和動(dòng)物健康造成危害，使肝臟、腎臟和胃腸道發(fā)生病變[12-14]，對(duì)人類健康造成威脅，《中華人民共和國(guó)藥典》（2015版）已收錄了19種中藥材黃曲霉毒素的限度檢查[15]，但并未對(duì)土鱉蟲(chóng)中的黃曲霉毒素限量標(biāo)準(zhǔn)有所規(guī)定暫未進(jìn)行控制。

截至目前，已有大量的真菌毒素的檢測(cè)方法，并從最初的薄層色譜法[16]逐漸發(fā)展到氣相色譜法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法、快速檢測(cè)技術(shù)等多種方法[17,18]，包括了儀器分析、化學(xué)分析、生物鑒定和免疫分析等方面[11]。這些方法可以分為快速篩選法和確證法兩大類，快速篩選法主要是酶聯(lián)免疫法[19]，此法對(duì)樣品前處理要求簡(jiǎn)單，不需要昂貴的設(shè)備，靈敏度很高，但該法需要的抗體抗原制備過(guò)程復(fù)雜，技術(shù)難度高且存在一定的假陽(yáng)性；確證法主要有氣相色譜法（GC）、液相色譜法（HPLC）及其與質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)法等[20]。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[21]可以同時(shí)提供目標(biāo)化合物的保留時(shí)間和分子結(jié)構(gòu)信息，對(duì)凈化要求低、靈敏度高、雜質(zhì)影響小、適合多組分同時(shí)分析。免疫親和柱凈化法是最常用的凈化方法，但該凈化方法大多數(shù)只能用于某一種或同一類型真菌毒素的凈化。如陳思穎等[22]采用免疫親和柱凈化，UPLC-MS/MS 測(cè)定了天麻藥材中黃曲霉毒素的含量。楊麗博等[23]采用免疫親和柱凈化-高效液相色譜法測(cè)定小麥粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇。關(guān)于多種真菌毒素的同時(shí)檢測(cè)，多采用多功能免疫親和柱凈化[24]或HLB 固相萃取柱[25]凈化，免疫親和柱利用抗原抗體特異性可逆結(jié)合的原理，而多功能免疫親和柱只針對(duì)幾種類型的真菌毒素進(jìn)行凈化富集，對(duì)于多種真菌毒素的檢測(cè)具有局限性。HLB固相萃取柱的保留機(jī)理為反相，通過(guò)一個(gè)“特殊的極性捕獲基團(tuán)”來(lái)增加對(duì)極性物質(zhì)的保留提供很好的水浸潤(rùn)性，可用于不同種類的真菌毒素的凈化處理。

本文通過(guò)HLB 固相萃取柱凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，建立了土鱉蟲(chóng)中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1，伏馬毒素B1、B2，赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素、T-2 毒素和桔青霉毒素共12種真菌毒素的檢測(cè)方法，以期為土鱉蟲(chóng)藥材中多種真菌毒素的含量測(cè)定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

島津LC30A-4500 Q-trap 型液質(zhì)聯(lián)用儀；Milli-Q系列超純水處理系統(tǒng)（美國(guó)密理博公司）；美國(guó)Waters Oasis 公司HLB 固相萃取柱（6 cc，200 mg）；Thermo Fisher ST16R型高速冷凍離心機(jī)；P-12-瑞士BUCHI平行蒸發(fā)儀；睿科AH-30全自動(dòng)均質(zhì)器。

1.2 材料

黃曲霉毒素混合對(duì)照品溶液（中國(guó)食品藥品檢定研究院，YSRJ-8KLK，黃曲霉毒素G2（AFG2）、黃曲霉毒素G1（AFG1）、黃曲霉毒素B2（AFB2）、黃曲霉毒素B1（AFB1）濃度分別為0.38 μg·mL?1、1.06 μg·mL?1、0.43 μg·mL?1、1.02 μg·mL?1），伏馬毒素B1（FB1）、（Pribolab，批 號(hào)：1700110，50 μg·mL?1）、伏 馬 毒 素B2（FB2）（Pribolab，批號(hào)：1601116，50 μg·mL?1），桔青霉毒素（Citrinin）（Pribolab，批號(hào)：1600926，101 μg·mL?1），T-2毒素（T-2）（Pribolab，批號(hào)：1601125，100 μg·mL?1），黃曲霉毒素M1（AFM1）（Pribolab，批號(hào)：1700201，10 μg·mL?1），嘔吐毒素（DON）（Pribolab，批號(hào)：1601020，100 μg·mL?1），玉米赤霉烯酮（ZEN）（Pribolab，批號(hào)：1601205，25 μg·mL?1），赭曲霉毒素A（OTA）（Pribolab，批號(hào)：1601006，10 μg·mL?1）。甲醇、乙腈為色譜純；醋酸銨為質(zhì)譜級(jí)。

1.3 色譜、質(zhì)譜條件

色譜柱：Phenomenex Kinetex XB-C18（1.7 μm，100 mm，2.1 mm）；流動(dòng)相5 mmol·L-1醋酸銨（pH=3.0）（A）-乙腈（B），梯度洗脫[10% B（0-5 min），20% B（5-6 min），45% B（6-30 min），10% B（30-35 min）]。流速為0.2 mL·min-1，柱溫為30℃。進(jìn)樣量為2 μL。色譜圖（圖1、圖2）。

黃曲霉毒素G1、G2、B1、B2、M1，桔青霉毒素，伏馬毒素B1、B2，T-2毒素采用ESI+測(cè)定；嘔吐毒素，赭曲霉毒素A，玉米赤霉烯酮采用ESI-測(cè)定。以三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀作為檢測(cè)器，電化學(xué)噴霧離子源（ESI）。采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，各化合物質(zhì)譜參數(shù)（表1）。

1.4 混合對(duì)照品溶液的配制

分別精密吸取上述對(duì)照品適量，加甲醇配置成黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、桔青霉毒素、T-2毒素、伏馬毒素B1、伏馬毒素B2、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A 以及嘔吐毒素濃度依次為為51 ng·mL?1、21.5 ng·mL?1、53 ng·mL?1、19 ng·mL?1、100 ng·mL?1、1000 ng·mL?1、300 ng·mL?1、100 ng·mL?1、100 ng·mL?1、150 ng·mL?1、100 ng·mL?1以及2000 ng·mL?1。

1.5 供試品溶液的制備

1.5.1 提取

稱取粉碎均質(zhì)土鱉蟲(chóng)樣品5.00 g 于50 mL 聚四氟乙烯離心管中，加入加入80% 乙腈溶液40 mL，勻漿提取1 min，離心20 min（離心速度8000 r·min-1），取上層清液于另一個(gè)聚四氟乙烯離心管中；將上清液減壓濃縮至5-6 mL 并用80% 乙腈溶液轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，加純水至刻度；取1 mL 于5 mL 容量瓶中，純水定容，待凈化。

1.5.2 凈化

圖1 正離子模式總離子流圖

圖2 負(fù)離子模式總離子流圖

預(yù)先用3 mL 甲醇和3 mL 純水活化柱子。精密吸取上述溶液4 mL，緩慢通過(guò)HLB 固相萃取柱凈化，流速控制在2-3 mL·min-1，直至有適量空氣通過(guò)，隨后用5 mL純化水淋洗，再用5 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，于平行蒸發(fā)儀上濃縮至近干，精密加入50% 乙腈溶液2 mL，0.22 μm膜過(guò)濾后，即得供試品溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理提取溶劑的選擇

對(duì)土鱉蟲(chóng)樣品提取溶劑的選擇，真菌毒素的提取通常采用極性溶液，主要提取液有乙腈水和甲醇水的不同比例溶液。本實(shí)驗(yàn)考察了80% 甲醇、70% 甲醇和70% 乙腈、80% 乙腈、90% 乙腈溶液的提取液，比較提取效率，發(fā)現(xiàn)在以乙腈作為提取液時(shí)，真菌毒素的提取回收率普遍增加，并且隨乙腈濃度的增加回收提取率也得到提高，以80% 乙腈溶液作為提取液能得到較高的回收率，提取效果更好結(jié)果見(jiàn)圖3。因此本實(shí)驗(yàn)采用80% 乙腈水溶液作為提取液。

2.2 質(zhì)譜條件的選擇

2.2.1 母離子的選擇

將黃曲霉毒素混合溶液配制成AFB1、AFB2、AFG1、AFG2濃度分別為25.5 ng·mL?1、10.75 ng·mL?1、26.5 ng·mL?1、9.5 ng·mL?1，嘔吐毒素配制成10010 ng·mL?1的單標(biāo)，各真菌毒素配制成10 ng·mL?1的單標(biāo)，根據(jù)各化合物分子的化學(xué)電離性質(zhì)，分別選用ESI+和ESI-作為離子化模式，通過(guò)針泵連續(xù)進(jìn)樣標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)的基礎(chǔ)上，獲得各毒素的母離子信息。結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、伏馬毒素B1、B2、桔青霉毒素和T-2毒素在ESI+模式下，可獲得較高的靈敏度；嘔吐毒素、赭曲霉毒素A 和玉米赤霉烯酮在ESI-模式下可以得到較好的響應(yīng)值。

表2 線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.2.2 子離子的選擇及碰撞電壓的優(yōu)化

根據(jù)歐盟（2002/657/EC）指令規(guī)定低分辨率質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)應(yīng)在確定母離子的基礎(chǔ)上選擇2個(gè)以上的子離子[26]。在確定各真菌毒素的母離子后，采用子離子掃描，設(shè)定掃描范圍，覆蓋可能的子離子質(zhì)量范圍。隨著碰撞能量的不斷增加，選擇響應(yīng)最強(qiáng)的2-3 個(gè)子離子作為候選。根據(jù)找到的離子對(duì)，通過(guò)MRM掃描模式優(yōu)化并獲得各毒素離子對(duì)的最佳DP和CE電壓值。

2.3 線性關(guān)系與靈敏度考察

將1.4配置的混合對(duì)照品溶液用甲醇稀釋，得到黃曲霉素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2、黃曲霉毒素M1、桔青霉毒素、伏馬毒素B1、伏馬毒素B2、T-2 毒素、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A的濃度分別為2.04 ng·mL?1、0.86 ng·mL?1、2.12 ng·mL?1、0.76 ng·mL?1、4 ng·mL?1、40 ng·mL?1、4 ng·mL?1、12 ng·mL?1、80 ng·mL?1、6 ng·mL?1、4 ng·mL?1。以峰面積對(duì)相應(yīng)真菌毒素的濃度作圖，結(jié)果表明待測(cè)化合物濃度與對(duì)應(yīng)峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（R2>0.99）；由于土鱉蟲(chóng)樣品對(duì)測(cè)定化合物存在基質(zhì)效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)中取不含真菌毒素的空白樣品為溶劑，將1.4項(xiàng)配制的混合對(duì)照溶液稀釋成系列濃度，進(jìn)樣檢測(cè)，按照10 倍噪音計(jì)算檢出濃度（定量限，LOQ），線性關(guān)系考察結(jié)果及檢測(cè)限、定量限測(cè)定結(jié)果詳見(jiàn)表2。

2.4 回收率試驗(yàn)

取同一批次土鱉蟲(chóng)樣品粉末約5 g（過(guò)二號(hào)篩），精密稱定，稱取18 份，6 份為一組，按低、中、高3 濃度水平分別精密加入混合對(duì)照品溶液0.25 mL、0.5 mL、1.0 mL，依次制備供試品溶液并測(cè)定含量，計(jì)算回收率，結(jié)果（表3）。由表3可以看出，12種真菌毒素的回收率為68.9% -110.2% ，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.5% -13.33% 。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取土鱉蟲(chóng)樣品粉末5 g（過(guò)二號(hào)篩），稱取6 份，精密稱定，精密加入加樣回收率用混合對(duì)照品溶液1 mL，依法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，結(jié)果為12種真菌毒素的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD% ）為0.58% -7.56% ，表明本實(shí)驗(yàn)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果良好（表4）。

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果

表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表5 樣品測(cè)定結(jié)果

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下供試品溶液，一日內(nèi)每隔6 h進(jìn)樣分析，記錄峰面積，結(jié)果表明，在24 h內(nèi)，供試品溶液保持穩(wěn)定。

2.7 實(shí)際樣品分析測(cè)定

對(duì)收集到的4 批土鱉蟲(chóng)樣品進(jìn)行真菌毒素測(cè)試，其中有三批樣品黃曲霉毒素類有檢出，并且超出限量標(biāo)準(zhǔn)，只有一批樣品檢出伏馬毒素B1、B2和T-2。具體測(cè)定結(jié)果（表5）。結(jié)果表明，土鱉蟲(chóng)藥材易被真菌毒素感染，應(yīng)采取有效措施避免污染。

3 討論

考慮HLB 柱的凈化原理，溶劑極性太弱，將得不到保留或保留很弱。需要對(duì)樣品溶液進(jìn)行稀釋處理，加大強(qiáng)極性溶劑的比例以增強(qiáng)分析物的富集。本實(shí)驗(yàn)采用80% 乙腈轉(zhuǎn)移定容，加純化水進(jìn)行稀釋處理后再經(jīng)HLB柱凈化富集。

液相色譜條件的優(yōu)化，選用了甲醇-5 mmol·L-1乙酸銨、乙腈：甲醇（1∶1）-0.01% 甲酸、甲醇-0.1% 甲酸為流動(dòng)相，分離效果均不理想，且得到的大多數(shù)真菌毒素離子對(duì)的峰型不好。選用乙腈-5 mmol·L-1醋酸銨為流動(dòng)相，采用合適的梯度洗脫條件，各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以實(shí)現(xiàn)較好的分離，但峰型不穩(wěn)定。真菌毒素在酸性條件下較為穩(wěn)定，本實(shí)驗(yàn)采用乙腈-5 mmol·L-1醋酸銨為流動(dòng)相，考察了5 mmol·L-1的醋酸銨在pH 為2.0、2.5、3.0、3.5 時(shí)色譜峰的信號(hào)。在pH=3.0 時(shí)，色譜峰的峰型更穩(wěn)定，質(zhì)譜信號(hào)值最強(qiáng)。

本實(shí)驗(yàn)采用空白提取液加標(biāo)法，即通過(guò)比較空白樣品提取液中加入標(biāo)準(zhǔn)溶液和相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)來(lái)考察基質(zhì)效應(yīng)。按照以下公式計(jì)算其基質(zhì)效應(yīng)，土鱉蟲(chóng)中多數(shù)化合物的SSE% 在90% 以下，表明土鱉蟲(chóng)樣品有基質(zhì)干擾作用。消除基質(zhì)效應(yīng)可通過(guò)采用合適的前處理方法、使用內(nèi)標(biāo)物或基質(zhì)外標(biāo)法等方法，但是由于同位素內(nèi)標(biāo)價(jià)格比較昂貴，實(shí)驗(yàn)成本較高，并且所分析的物質(zhì)化學(xué)性質(zhì)差異較大，很難找到一種或幾種化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物[27]。實(shí)驗(yàn)中可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)情況來(lái)確定是否需要進(jìn)行空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備，本實(shí)驗(yàn)的線性關(guān)系曲線采用空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液來(lái)制備。

本文研究發(fā)現(xiàn)土鱉蟲(chóng)藥材基質(zhì)較為復(fù)雜，易產(chǎn)生的毒素種類有黃曲霉毒素類、伏馬毒素類以及玉米赤霉烯酮等。《中國(guó)人民共和國(guó)藥典》（2015 版）[15]一部規(guī)定了黃曲霉毒素在中藥材中的最高限量標(biāo)準(zhǔn)，即AFB1與AF（B1+B2+G1+G2）不得高于5 μg·kg?1和10 μg·kg?1，但并未制定其他毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)。我國(guó)目前只規(guī)定了赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮等毒素在食品和飼料中的限量。GB2761-2017《食品中真菌毒素限量》規(guī)定了赭曲霉毒素A 在食品中的限量不得高于5 μg·kg?1，而玉米赤霉烯酮在食品中的限量為不得高于60 μg·kg?1[28]。歐盟規(guī)定嬰幼兒玉米制品中FB（含F(xiàn)B1和FB2）的總量為0.3 mg·kg?1，谷粉及玉米粉中嘔吐毒素的限量為0.75 mg·kg?1玉米種的限量值為4 mg·kg?1；美國(guó)食品藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）規(guī)定玉米種FB1、FB2和FB3總量的最高限量值為2 mg·kg?1，規(guī)定供人類使用的磨粉用小麥中嘔吐毒素的限量為1 mg·kg?1；我國(guó)規(guī)定谷物及其制品小麥、大麥、麥片、玉米、玉米制品中嘔吐毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)為1 mg·kg?1，有關(guān)文獻(xiàn)建議將中藥中嘔吐毒素的限度規(guī)定為1 mg·kg?1[29,30]。本實(shí)驗(yàn)中有三份土鱉蟲(chóng)樣品黃曲霉毒素超出限量，其中一份黃曲霉毒素G1 含量高達(dá)89.0 μg·kg?1，一份樣品檢出赭曲霉毒素A 含量為8.2 μg·kg?1，一份樣品檢出玉米赤霉烯酮含量高達(dá)79.8 μg·kg?1。土鱉蟲(chóng)藥材的炮制工藝為曬干、沸水泡或文火炒等。經(jīng)炮制后還保留有一定的水分，若在儲(chǔ)存過(guò)程中溫度、濕度以及通風(fēng)條件等控制不當(dāng)，易生成霉菌產(chǎn)生真菌毒素。因此，應(yīng)進(jìn)一步改善對(duì)土鱉蟲(chóng)藥材的管理措施，減少污染。