蒙藥巴特日-7 抗炎作用和急性毒性實(shí)驗(yàn)研究
——以有效部位為研究對(duì)象＊

李淑紅，包黎明，李淑艷＊＊

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)護(hù)理學(xué)院 通遼 028000；2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院 通遼 028000）

蒙成藥巴特日-7，系由草烏葉、訶子、多葉棘豆、茜草、黑云香、銀朱和麝香等七味藥共同配合而成的水丸制劑。具有殺粘、清熱解毒的功效。對(duì)瘟疫、麻疹、痘疹、腸痛、胸痛、白喉塞等疾病具有治療作用[1]。現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)證明巴特日-7 具有抗病毒、抗菌[2]、鎮(zhèn)痛[3]以及增強(qiáng)免疫等藥理作用，特別是蒙醫(yī)臨床治療腸炎的首選藥物，具有蒙藥抗生素之稱。

蒙藥傳統(tǒng)給藥方式以煎煮為主，因此，本實(shí)驗(yàn)以巴特日-7 水提物作為對(duì)照，為開(kāi)辟巴特日-7 新藥，以巴特日-7有效部位作為研究對(duì)象，對(duì)其巴特日-7有效部位抗炎作用和安全方面進(jìn)行了評(píng)價(jià)。通過(guò)巴特日-7不同提取部位對(duì)小鼠單核巨噬（RAW264.7）細(xì)胞增殖的影響、脂多糖（LPS）刺激RAW264.7細(xì)胞釋放腫瘤壞死因子（TNF-α）和白介素6（IL-6）的影響以及對(duì)體外抗菌活性篩選等前期研究結(jié)果表明，巴特日-7有效部位是乙酸乙酯-正丁醇部位。目前，對(duì)有效部位的化學(xué)成分已進(jìn)行了分析評(píng)價(jià)，目前缺乏藥效學(xué)和相關(guān)安全性評(píng)價(jià)方面的研究。本研究選擇巴特日-7 有效部位為受試藥物，以巴特日水提物為對(duì)照藥，對(duì)巴特日-7 有效部位抗炎作用和急性毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為臨床應(yīng)用和安全用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠,體重18-22 g，♀♂兼用（遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK-2015-0001）；SPF級(jí)大小鼠生長(zhǎng)繁殖飼料喂養(yǎng)，自由飲水，適應(yīng)3 d后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)：內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要儀器設(shè)備、藥物及試劑

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（N-1300，上海愛(ài)朗儀器有限公司）；型電子天平（AUY120D，日本島津）。

巴特日-7，自制；草烏葉、多葉棘豆，采自內(nèi)蒙古扎魯特旗自然保護(hù)區(qū)罕山；茜草、訶子、麝香、黑云香和銀朱等購(gòu)買(mǎi)于澤強(qiáng)藥典，由內(nèi)蒙古民族大學(xué)布和巴特爾教授鑒定為正品。阿司匹林片（批號(hào)20151104，北京中新制藥廠）；角叉菜膠（批號(hào)127H1120，Sigma 公司）；二甲苯為分析純。

1.3 巴特日-7不同提取部位的制備

按處方比例（草烏葉250 g、訶子250 g、茜草100 g、多葉棘豆100 g、黑云香100 g、銀朱50 g、麝香0.5 g）稱取巴特日-7 處方中各單味藥材共7.5 kg，加入10 倍量95% 乙醇回流提取（4 h×3），合并提取液，減壓濃縮法揮去溶劑，得巴特日-7乙醇提取物。將醇提物冷凍干燥揮去溶劑，用水懸浮后，分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等溶劑萃取，依次得到514.5 g 石油醚提取物、372 g 氯仿提取物、602.25 g 乙酸乙酯提取物、213.75 g正丁醇提取物、108.1 g水殘余部位，提取率分別為6.86% 、4.96% 、8.03% 、2.85% 和1.44% 。依次取上述乙酸乙酯-正丁醇部位的干浸膏適量,加水配制成濃度為0.296 g·mL-1的供試液（用藥劑量均按照生藥量計(jì)算）。

按照處方比例配置巴特日-7共0.93 kg，加入10倍量水煎煮1.5 h，得到的藥渣中分別加入8、6倍量水，再分別煎煮1、0.5 h，合并提取液并濃縮，得522.6 g 巴特日-7 水提物（簡(jiǎn)稱巴特日-7），提取率為56.2% 。取上述提取物加水配制成濃度為0.296 g·mL-1的供試液（用藥量均按照生藥量計(jì)算）。

1.4 二甲苯所致小鼠耳廓腫脹實(shí)驗(yàn)

取80 只昆明種小鼠（體重18-22 g），♀♂兼用，隨機(jī)均分為空白對(duì)照組（灌胃生理鹽水20 mL·kg-1）、陽(yáng)性對(duì)照組（灌胃阿司匹林0.25 g·kg-1）、巴特日-7 低、中、高劑量組、有效部位低、中、高劑量組。巴特日-7和有效部位低、中、高劑量組的給藥量均分別為0.74 g·kg-1、1.48 g·kg-1和2.96 g·kg-1（以上給藥量均按照生藥劑量計(jì)算），用水溶解，每組10只。每日給藥1次，共6 d，最后給藥1 h后，在小鼠右耳的正反兩面涂抹25μL二甲苯致炎，左耳為對(duì)照。在致炎1h以后用頸椎脫臼的方法使動(dòng)物處死，使用打孔器將每只小鼠左右耳相同部位沖下8-9 mm 的圓片，稱重[4-7]并對(duì)腫脹度和抑制率進(jìn)行計(jì)算。腫脹度=腫脹耳重量-對(duì)照耳重量；抑制率（% ）＝（空白對(duì)照組動(dòng)物耳腫脹-給藥組動(dòng)物耳腫脹）／空白對(duì)照組動(dòng)物耳腫脹×100% 。

1.5 角叉菜膠致小鼠足腫脹實(shí)驗(yàn)

取80 只昆明種小鼠（體重18-22 g），♀♂兼用，分組與給藥方法同上述“2.2”相同。小鼠在末次灌胃給藥1 h后，對(duì)其每只小鼠右后足跖原的厚度進(jìn)行測(cè)量，并且將1% 濃度的角叉菜膠在小鼠右后足跖掌心皮下注射100μL致炎，然后用游標(biāo)卡尺對(duì)小鼠致炎1、2、3、4、5，6 h右后足跖厚度分別進(jìn)行測(cè)量并計(jì)算[8]。腫脹度=動(dòng)物右后足致炎后厚度-動(dòng)物右后足致炎前厚度，抑制率=（空白對(duì)照組動(dòng)物足跖腫脹度-給藥組動(dòng)物足跖腫脹）／空白對(duì)照組動(dòng)物足跖腫脹×100% 。

1.6 半數(shù)致死量（LD50）的測(cè)定

取70 只昆明種小鼠（體重18-22 g），♀♂兼用，隨機(jī)均分為空白對(duì)照組（灌胃生理鹽水20 mL·kg-1）、巴特日-7低、中、高劑量組和有效部位低、中、高劑量組，每組10 只。巴特日-7 和有效部位低、中、高劑量組的給藥量均分別為0.74 g·kg-1、3.70 g·kg-1、18.50 g·kg-1（以上給藥量均按照生藥劑量計(jì)算，以1：5：25 比例配置），動(dòng)物禁食不禁水12 h，并按體重以20 mL·kg-1灌胃給藥，每日1次，共1周，停藥后觀察1周[9-11]。

小鼠灌胃后12 h 內(nèi)，對(duì)動(dòng)物的毒性反應(yīng)情況進(jìn)行觀察，包括動(dòng)物外觀、精神狀態(tài)、行為、食欲、被毛、呼吸及口腔、眼、鼻是否出現(xiàn)異常分泌物，并對(duì)動(dòng)物體重變化以及死亡情況等進(jìn)行詳細(xì)記錄。

1.7 最大給藥量實(shí)驗(yàn)

取昆明種小鼠30 只（體重18-22 g），♀♂兼用，隨機(jī)均分為空白對(duì)照組（灌胃生理鹽水20 mL·kg-1）、巴特日-7 高劑量組（灌胃88.8 g·kg-1）、有效部位高劑量組（灌胃88.8 g·kg-1），每組10只，以上給藥量均按照生藥劑量計(jì)算，相當(dāng)于臨床成人用藥劑量0.074 g·（kg·d）-1的120 倍左右。將巴特日-7和乙酸乙酯-正丁醇部位個(gè)劑量藥物用純凈水配制成為2.22 g·mL-1，以小鼠能耐受的最大給藥體積40 mL·（kg·d）-1為給藥標(biāo)準(zhǔn)，每日1次，共1周，停藥后觀察1周[12-14]。

小鼠灌胃后，對(duì)動(dòng)物的毒性反應(yīng)[15]進(jìn)行觀察，記錄死亡情況，毒性死亡的動(dòng)物進(jìn)行尸檢，做組織病理學(xué)分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用xˉ±s表示，采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；半數(shù)致死量（LD50）采用Bliss法（加權(quán)回歸幾率）計(jì)算[16]。

表1 巴特日-7有效部位對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響(0)

表1 巴特日-7有效部位對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響(0)

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

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2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響

結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，巴特日-7 和有效部位中劑量組和高劑量組能明顯抑制小鼠對(duì)二甲苯所致耳廓腫脹，并具有顯著性差異（P＜0.01，P＜0.05）；與空白對(duì)照組比較，巴特日-7 和有效部位低劑量組對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹具有抑制效應(yīng)，但無(wú)顯著性差異（P＞0.05），耳腫脹抑制率與給藥劑量呈正比關(guān)系；巴特日-7 與有效部位之間沒(méi)有顯著差異（表1，圖1，圖2）。

2.2 對(duì)角叉菜膠致小鼠足跖腫脹的影響

由表2可知，巴特日-7、有效部位不同劑量組在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)可明顯抑制大鼠的足腫脹。其中，與空白對(duì)照組比較，巴特日-7 低劑量組在致炎后1、2 h 作用明顯，而中劑量組和高劑量組在致炎后1-5 h 對(duì)小鼠致炎后足跖腫脹具有抑制作用（P＜0.05）。與空白對(duì)照組比較，巴特日-7 有效部位低、中和高劑量組在致炎后1-5 h 作用明顯，對(duì)小鼠足跖腫脹具有顯著的抑制作用（P＜0.05）。巴特日-7 與有效部位各組之間沒(méi)有顯著差異（表2，圖3）。

圖1 巴特日-7有效部位對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響(n=10)

圖2 巴特日-7有效部位對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹的抑制作用(n=10)

2.3 半數(shù)致死量（LD50）的測(cè)定

巴特日-7 和有效部位各劑量組灌胃給藥后小鼠未出現(xiàn)中毒反應(yīng)，精神狀態(tài)良好、呼吸正常、鼻、眼、口腔等無(wú)異常分泌物。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，巴特日-7、有效部位組的各劑量組小鼠體重變化比較時(shí)，無(wú)顯著性差異（P＞0.05）（表3，圖4）。

表2 巴特日-7有效部位對(duì)角叉菜膠致小鼠足跖腫脹的影響(xˉ±s,n=10)

圖3 巴特日-7有效部位對(duì)角叉菜膠致小鼠足跖腫脹的影響(n=10)

表3 巴特日-7有效部位各組小鼠LD50實(shí)驗(yàn)體重變化(±s,n=10)

表3 巴特日-7有效部位各組小鼠LD50實(shí)驗(yàn)體重變化(±s,n=10)

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

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圖4 各組小鼠LD50實(shí)驗(yàn)體重變化(n=10

蒙藥復(fù)方巴特日-7 各單味藥材均為低毒或無(wú)毒藥材，故此復(fù)方毒性低，未能測(cè)得該復(fù)方的LD50，因此，按照中藥、天然藥物急性毒性研究指導(dǎo)原則，進(jìn)行最大給藥量實(shí)驗(yàn)。

2.4 最大給藥量實(shí)驗(yàn)

給藥后對(duì)動(dòng)物觀察了1周，結(jié)果動(dòng)物精神狀態(tài)、毛色等無(wú)明顯異常；呼吸無(wú)異常、口腔、眼、鼻均無(wú)異常分泌物。以小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在最大給藥體積和最大給藥量的情況下，無(wú)法測(cè)得LD50。最大給藥量實(shí)驗(yàn)中，給藥量相當(dāng)于臨床成人用藥劑量0.074 g·（kg·d）-1的120倍左右，未出現(xiàn)毒性現(xiàn)象，表明巴特日-7藥物毒性低，臨床短期常用藥量安全可靠。

3 討論

巴特日-7作為一種治療腸炎疾病的蒙藥制劑，在蒙醫(yī)臨床上廣泛使用，且效果良好。本方具有止痛、殺粘功能的草烏葉為君藥；配以具有殺粘、止痛、消腫功能的多葉棘豆，殺粘、開(kāi)竅功能的麝香，殺粘、止痛功能的黑云香為臣藥；草烏葉(Aconiti Kusnezoffii Folium)為毛茛科植物北烏頭AconitumkusnezoffiiReichb.的干燥葉,其主要含有總生物堿成分[17-20]，具有殺粘、清熱、止痛、抗炎等功效[21]；多葉棘豆（Herba Oxytropis myriophylla）為豆科植物狐尾藻棘豆（Oxytropis myriophylla（pall）DC.）的干燥地上部分，其主要成分[22-27]含有黃酮類、木脂素類、酚苷類、三萜皂苷類以及生物堿類，具有殺黏、清熱、止痛等功效[28]；麝香為鹿科動(dòng)物麝（Mosch-us moschiferusL）雄體香囊中的干燥分泌物。主要含有麝香酮、降麝香酮、麝香醇等成分，具有抗炎[29,30]、增強(qiáng)免疫功能[31]等作用。本研究為闡明該復(fù)方藥效成分、作用機(jī)制及進(jìn)一步臨床二次開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

作為新藥資源使用之前，需要進(jìn)行有效性和安全性評(píng)價(jià)。復(fù)方制劑提取并濃縮后會(huì)導(dǎo)致化學(xué)組分和有效成分量的變化，研究報(bào)道[32]，相同的劑量下，活性部位篩選時(shí)巴特日-7 與提取物乙酸乙酯-正丁醇部位（即有效部位）對(duì)RAW264.7 細(xì)胞(小鼠單核巨噬細(xì)胞)增值和LPS刺激RAW264.7細(xì)胞釋放TNF-ɑ和IL-6的作用中均無(wú)明顯差異。但是目前關(guān)于急性炎癥動(dòng)物模型和毒性研究未見(jiàn)報(bào)道。

炎癥是機(jī)體對(duì)致炎因子引起的以防御為主的病理過(guò)程[33,34]。急性炎癥表現(xiàn)為紅腫熱痛等癥狀，并使毛細(xì)血管通透性增加而引起炎癥滲出和腫脹。巴特日-7具有清熱解毒、消“粘”功效。蒙藥巴特日-7,為腸刺痛及粘熱癥常用主方，是蒙醫(yī)臨床治療腸炎的首選藥物，在蒙醫(yī)臨床上使用的劑型是水丸制劑[35]。本實(shí)驗(yàn)采用了急性炎癥動(dòng)物模型，為減少實(shí)驗(yàn)誤差選擇雄雌各半的昆明種小鼠，對(duì)其巴特日-7水提取物作為整體部位與巴特日-7 活性部位（即有效部位）的抗炎作用進(jìn)行了探討。研究結(jié)果表明，巴特日-7 高、中劑量組和有效部位高、中劑量組對(duì)二甲苯所致小鼠耳廓腫脹和角叉菜膠所致足跖腫脹均有明顯的抑制作用，但巴特日-7和有效部位之間均無(wú)顯著性差異，其抑制作用與陽(yáng)性對(duì)照組相當(dāng)。巴特日-7低劑量組在2 h后致炎作用逐漸減低，而有效部位低劑量組在3 h后致炎作用逐漸降低，表明在相同的劑量下巴特日-7和有效部位產(chǎn)生抑制炎癥的作用時(shí)間點(diǎn)是有差異的。說(shuō)明其能夠有效緩解炎癥發(fā)生過(guò)程的早期癥狀，這可能與其明顯抑制炎癥早期血管通透性亢進(jìn)和水腫有關(guān)，但具體的抗炎機(jī)制有待于進(jìn)一步闡明。

急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠對(duì)巴特日-7和乙酸乙酯-正丁醇提取部位（有效部位）的最大給藥體積和最大給藥量的情況下給藥量相當(dāng)于臨床成人每公斤體重日用藥劑量0.074 g 的120 倍左右，給藥后小鼠未出現(xiàn)明顯中毒現(xiàn)象，也無(wú)死亡現(xiàn)象，且該藥對(duì)小鼠體重增加無(wú)明顯影響，一般按體質(zhì)量計(jì)算，小鼠最大給藥量相當(dāng)于成人臨床用藥量100倍以上則認(rèn)為是較為安全的[36]。表明巴特日-7 有效部位毒性小，在一定劑量?jī)?nèi)使用是安全的。同時(shí)顯示出該藥具有良好的開(kāi)發(fā)利用前景。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，巴特日-7有效部位抗炎作用與急性毒性同巴特日-7整體部位比較，發(fā)現(xiàn)兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本研究以期為巴特日-7 的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供了初步的藥效學(xué)和毒理學(xué)基礎(chǔ)，其臨床應(yīng)用的有效性及安全性尚需深入研究。