消癌解毒方對H22 荷瘤小鼠血管生成相關因子的影響＊

李 黎，吳勉華，周紅光，李沐涵，李文婷，季 漪，馬艷霞，雒慧娟

（1.南京中醫藥大學第一臨床醫學院腫瘤研究所 南京 210023；2.江蘇省中醫藥防治腫瘤協同創新中心 南京 210023；3.南京中醫藥大學基礎醫學院 南京 210023）

2018年2月國家癌癥中心發布了最新一期的全國癌癥統計數據[1]，肝癌已經成為我國繼肺癌、胃癌、結直腸癌之后，發病率排名第四的癌癥；死亡率居惡性腫瘤第二位。肝癌早期癥狀不明顯，一旦發現，大多屬于晚期，目前肝癌的治療首選手術治療（肝移植、肝切除），此外介入治療、消融治療、化療、靶向治療等方法也多為臨床應用[2]，但復發率高，根治不徹底，治療類型有限，存在費用昂貴等方面的問題仍是肝癌治療中的難題[3]。中醫藥在腫瘤治療中正發揮著越來越重要的作用，主要體現在減輕副作用，改善患者癥狀，提高生存質量等方面[4]。

國醫大師周仲瑛教授認為腫瘤的發生主要歸結于癌毒致病，正氣虧虛，肝癌的主要病理因素為濕熱瘀毒結聚，治療以清化濕熱、化瘀解毒為主，在此基礎上加用散結消癥之品。消癌解毒方主要有白花蛇舌草、僵蠶、蜈蚣、麥冬等藥組成，為周仲瑛教授臨床常用經驗方；經臨床實踐證明，本方配合化療治療中晚期惡性腫瘤，與單純化療相比，合用組患者CD3+、CD4+及NK 活性顯著升高，證明使用消癌解毒方配合化療可顯著提高患者抗腫瘤免疫能力，使患者化療完成率顯著提高，生活質量明顯改善[5]。H22 腫瘤細胞株屬小鼠的肝細胞瘤，1963 年由上海藥物研究所引進，變成腹水型瘤株。H22荷瘤小鼠是將腹水型H22 肝癌細胞種與ICR小鼠腋下造成的移植瘤小鼠模型，國內學者對H22 細胞生物特性、免疫學等方面做了深入的研究，其移植瘤模型用于腫瘤研究及藥物篩選已經被廣泛認可[6]。已有實驗研究證明[7]，該方能夠通過多通路、多途徑影響H22 荷瘤小鼠移植瘤生長，凋亡及移植小鼠的免疫功能，發揮抗腫瘤作用。本實驗主要探討消癌解毒方對腫瘤血管生成的影響，進一步探討其抗腫瘤的作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物

清潔級ICR 小鼠，雄性，體質量18±2 g。購自南京大學-南京生物醫藥研究院，實驗動物生產許可證SCXK（蘇）2015-0001；實驗動物使用許可證SYXK（蘇）2014-0001。南京市鼓樓醫院科研中心提供H22瘤株種鼠。

1.2 實驗藥品

白花蛇舌草、太子參、蜈蚣、僵蠶等中藥購自安徽省亳州市中西藥有限公司，由南京中醫藥大學藥學院吳皓教授鑒定，消癌解毒方共81 g，煎煮2 次，第一次煎煮前，加水8 L，浸泡飲片1 h，加熱回流提取2 h，收集提取液；提取物殘渣冷卻降溫，加6 L 水，加熱回流提取2 h，收集提取液。兩次提取液合并，旋轉蒸發器濃縮，至含生藥量2 g·L-1，-20℃保存；注射用順鉑20毫升/支(齊魯制藥有限公司)。

1.3 主要試劑

Trizol ( 美 國invitrogen，批 號：115596- 026)；Ribonuclease Inhibitor ( 美 國life technology，批 號：c10777000)；MMLV 反轉錄酶（TAKARA，批號：TRT-101）；qPCR Master Mix（南京諾唯贊，批號：Q111-02/03）；VEGF 抗體、（Santa Cruze，批號：sc-7269）；TGF-β抗體（Cell Signaling Technology，批號：4），MMP2 抗體、CXCL2 抗體（Abcam，批號：ab37150、ab9777）；各引物有上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表1；VEGF、MMP2、TGF-β、CXCL2 Elisa 試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號：EK0541、EK0460、EK0515、EK0542）；

1.4 主要儀器

超微量生化分光光度計（ScanDrop，analytikjena）；穩壓穩流電泳儀（DYY-8，北京六一儀器廠）；微型電泳槽（H6-1，上海精益有機玻璃制品儀器廠）；Realtime 實 時 定 量PCR 儀（Quant Studio 5，life technology）；酶標儀（Tecan Spark 10M）。

表1 Realtime-PCR引物列表

2 方法

2.1 H22荷瘤小鼠移植瘤模型制備及分組

H22 荷瘤種鼠由南京鼓樓醫院贈送，碘酒消毒腹部，抽取0.2 mL種鼠腹水接種至2只小鼠腹腔，待長出腹水，每鼠抽取0.2 mL，接種至4只小鼠腹腔。無菌條件下抽取所有腹水瘤小鼠的腹水，以無菌生理鹽水稀釋，離心，重懸，計數，調整細胞濃度至1×108ml-1，每只ICR小鼠右腋下接種0.2 mL的細胞懸液。

2.2 實驗分組及給藥方法

小鼠接種瘤細胞3 d后，開始分組給藥，隨機分為空白組，陽性藥（即順鉑組），治療組（即消癌解毒方低、中、高劑量組），每組10只。其中空白組每日灌胃生理鹽水，根據《藥理實驗方法學》換算消癌解毒方給藥劑量，陽性藥組每日順鉑組腹腔注射（1 mg·kg-1）治療組每日灌胃低、中、高劑量消癌解毒方（10 g·kg-1、30 g·kg-1、90 g·kg-1）每天給藥1次，連續給藥10 d。

2.3 移植瘤的腫瘤抑制作用

給藥10 d后，次日處死小鼠，分別稱取各組小鼠體質量、各組瘤塊重量，計算抑瘤率。

抑瘤率（% ）=（空白組瘤體質量－給藥各組瘤體質量）/空白組瘤體質量×100% 。

2.4 全基因組表達譜芯片檢測

每組取一個瘤體樣本，送至上海康成生物工程有限公司，做全集因組表達譜芯片檢測。使用Agilent 芯片掃描儀掃描芯片信號，收集數據，數據根據空白組進行標準化，計算各給藥組相對于空白組的fold change（實驗組標記信號/空白組標記信號），其中fold change ≥2 者標記為表達顯著上調基因，Fold change ≤0.5為表達顯著下調基因。

表2 消癌解毒方對小鼠H22荷瘤小鼠移植瘤的抑制作用(n=10±s)

表2 消癌解毒方對小鼠H22荷瘤小鼠移植瘤的抑制作用(n=10±s)

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01。

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表3 STAT1、VEGF、MMP2、TGF-β、CXCL2全基因芯片檢測結果

2.5 各組小鼠血清VEGF、MMP2、TGF-β、CXCL2因子的檢測

給藥10 d 后，次日處死小鼠，各組小鼠眼眶取血，室溫靜置2 h，3000 r ?min-1離心10 min，收集上清，每組取3個血清樣本，按照Elisa試劑盒說明書進行檢測。

2.6 各組腫瘤組織STAT1、VEGF、MMP2、TGF-β、CXCL2基因的表達

每組隨機抽取3個瘤體樣本，稱量瘤體重量，加入適量的TRIZOL試劑，制備RNA樣本；引物設計見表1；使用樣品的RNA 進行cDNA 合成；制備用于繪制標準曲線的梯度稀釋DNA模板；將配置的PCR反應溶液置于Realtime PCR儀上進行PCR反應.

2.7 western blot法測定STAT1、VEGF、MMP2、TGF-β、CXCL2蛋白表達

各組取3個腫瘤組織樣本，MP組織處理器破碎各腫瘤組織，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，用裂解緩沖液將各組蛋白稀釋至相同濃度，加入一定量的上樣緩沖液，并煮沸5 min，10% SDS-PAGE 凝膠電泳，電泳結束后，采用半干法進行轉膜，5% 脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗STAT1、VEGF、MMP2、TGF-β、CXCL2按照說明書1∶1000稀釋，4℃孵育過夜，二抗按照說明書1∶5000 稀釋，室溫孵育2 h，化學發光法曝光條帶，采用Image Lab進行條帶分析。

3 統計學分析

統計分析采用SPSS17.0 軟件進行處理。實驗數據以xˉ±s表示，各組間的數據比較采用One-way ANOVA統計學分析，P<0.05為差異有統計學意義。

4 結果

4.1 消癌解毒方對H22荷瘤小鼠移植瘤的抑制作用

與空白組比較，消癌解毒方低、中、高劑量組、順鉑組H22 荷瘤小鼠移植瘤瘤重降低，差異具有統計學意義(P＜0.05)，提示消癌解毒方灌胃給藥對H22小鼠移植瘤具有較好的抑制作用，空白組瘤體重1.187 ±0.259 g，表示腫瘤模型成功。實驗結果見表2。

4.2 全基因組芯片檢測結果

本次基因芯片共檢測41000 條基因，相關實驗結果已經發表在中國中西醫結合雜志[7]。對芯片檢測結果進行分析發現，與空白組比較，CXCL2、VEGF基因在消癌解毒方低劑量組為表達下調基因，MMP2、TGF-β、CXCL2基因在消癌解毒方中劑量組為表達下調基因，STAT1基因在消癌解毒方的高劑量組為表達上調基因，MMP2、CXCL2基因在消癌解毒方的高劑量組為表達下調基因，各基因的具體上調/下調結果（表3）。

4.3 各組VEGF、MMP2、TGF-β、CXCL2 細胞因子的檢測

與空白組比較，消癌解毒方低、中、高劑量組及順鉑組血清VEGF、MMP2、TGF-β、CXCL2細胞因子含量顯著降低，差異具有統計學意義（P<0.05），實驗結果見表4。

4.4 各組腫瘤組織STAT1、VEGF、MMP2、TGF-β、CXCL2基因的表達

與空白組比較，STAT1基因在消癌解毒方各劑量組及順鉑組瘤體中表達上調，VEGF、MMP2、CXCL2基因在各消癌解毒方及順鉑組組瘤體中表達下調，實驗結果具有統計學差異（P<0.05，P<0.01），TGF-β基因在消癌解毒方低、中劑量及順鉑組表達顯著降低，差異具有統計學意義（P<0.05，P<0.01），TGF-β在消癌解毒方高劑量組中表達降低，但無統計學意義，實驗結果見表5。

表4 消癌解毒方對VEGF、MMP2、TGF-β、CXCL2細胞因子的影響

表5 各組目的基因表達的相對差異(n=

表5 各組目的基因表達的相對差異(n=

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01。

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4.5 各組腫瘤組織STAT1、VEGF、MMP2、TGF-β、CXCL2蛋白的表達

Western blot 實驗結果顯示，與空白組比較，消癌解毒方不同劑量組均可STAT1 蛋白的表達升高，VEGF、MMP2、TGF-β、CXCL2的蛋白表達降低，差異極顯著（P< 0.01），各組蛋白條帶及分析結果見圖1 及表6。

5 討論

《黃帝內經》中根據臨床表現及病因病機，將肝癌據歸為中醫“癥瘕”、“積聚”、“脅痛”等范疇，國醫大師周仲瑛教授認為[8]，正氣虧虛為肝癌發病基礎，氣虛則血瘀，瘀滯日久則結與肋下，形成結塊，導致脅痛、胸悶等癥；在治療中周老注重標本兼施，抗癌解毒，扶正驅邪藥物同用，臨床取得良好療效。

圖1 各組相關蛋白的表達

STAT1 是首先被發現的STATs 家族成員，作為潛在的轉錄因子，能夠被干擾素（IFNs）以及其他多種信號分子激活[9]，STAT1 被激活以后，主要參與細胞的增殖、凋亡，被認為是一種抑癌基因，在腫瘤治療中，因此STAT1也被認為是一種新的治療靶點[10,11]。Parkin等[12]學者研究認為，VEGF能夠促進血管內皮細胞的增殖，促進腫瘤細胞分化、增殖、遷移能力，增加腫瘤組織氧供應，形成纖維網絡結構從而促進腫瘤細胞的遷移，導致腫瘤發生。有研究發現，IFN-γ/STAT1 信號激活，可以抑制VEGF的生物活性，從而抑制血管生成，同時在發展期的胰腺癌研究中發現，STAT1 表達的缺失可以增加VEGF的表達水平，從而促進腫瘤生長，侵襲以及轉移[13]。在血管新生早期，基底膜降解，使腫瘤細胞浸潤和遷移是必要步驟，VEGF 可通過活化內皮細胞釋放蛋白水解酶，從而促進基質降解，促進腫瘤的迅速發展。同時MMPs通過激活、降解細胞外基質，釋放更多的VEGF。VEGF 與MMPs 相互作用，迅速促進了腫瘤的發展和侵襲轉移。MMP2 降解Ⅳ型膠原最主要的酶，通過降解基質，可以釋放更多的生長因子，既促進了MMPs 的合成，也上調了VEGF 的功能[14]。TGF-β是具有生長功能的多肽類細胞因子，以多種形式參與血管生成、細胞分化及轉移等。在腫瘤組織中低濃度TGF-β作為血管生成因子促進了腫瘤組織新生血管的形成，調節了血管內皮生長因子的旁分泌功能，促進生成了內皮細胞和毛細血管腔，良好的促進了腫瘤細胞的生長環境[15]，同時TGF-Β可以通過多種途徑增強其誘導腫瘤血管生成的作用，因此TGF-β或許也可以成為新的腫瘤治療靶點[16]。CXC類趨化因子具有促進腫瘤血管生成的作用，包括CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7 和CXCL8，這些趨化因子可直接作用于血管內皮細胞促進血管生成，從而介導腫瘤的生長和轉移[17]。實驗研究發現，CXCL2 主要在腫瘤及感染的炎癥反應期高表達，從而募集更多的中性粒細胞，這些中性粒細胞可以合成和釋放大量的與血管生成相關的因子，如血管內皮細胞生長因子等，從而促進腫瘤的發展[18]。

表6 消癌解毒方對H22小鼠移植瘤中相關蛋白表達的影響

對于全基因組芯片結果的分析，主要研究了STAT1基因以及與腫瘤血管生成相關的基因的改變，并挑選了表達差異顯著的VEGF、MMP2、TGF-β、CXCL2進行進一步的實驗驗證。實驗結果證明消癌解毒方作用能夠上調抑癌基因STAT1及蛋白的表達，降低VEGF、MMP2、TGF-β、CXCL2基因及蛋白的表達，抑制腫瘤血管生成相關的基因及蛋白的表達。中醫對腫瘤的病機認識中，正氣虧虛是基礎，由此才發生痰、瘀、毒等實質，有學者認為癌毒邪蓄積是腫瘤血管生成的前提，正氣虛損是腫瘤血管生成的內在因素，瘀血內結則是其主要病理變化。因此，解毒、扶正、活血等是中醫藥調控腫瘤血管生成的重要治則，是進一步研究中藥抗腫瘤血管生成機制的切入點[19]。本方中蛇舌草、山慈菇具有清熱解毒、消癰散結、化痰散結的功效；僵蠶、蜈蚣具有息風止痙的功效，與太子參、麥冬配合有助于腫塊的消解，發揮抗腫瘤作用，由于方中發揮抑制血管生成作用的主要物質基礎尚不清楚，后續本課題組將進一步深入研究。