不同炒制程度下決明子中11 種成分含量變化研究＊

楊 冰，秦昆明，李偉東,3，鄭艷萍，金俊杰,3＊＊，蔡寶昌,＊＊

（1.南京中醫(yī)藥大學國家教育部中藥炮制規(guī)范化及標準化工程研究中心 南京210023；2.南京海昌中藥集團有限公司 南京 210061；3.江蘇海昇藥業(yè)有限公司南京 210061；4.淮海工學院藥學院 連云港 222005）

決明子為豆科植物決明Cassia obtusi foliaL.或小決明Cassia toraL.的干燥成熟種子，具清熱明目、潤腸通便的功效[1]。現(xiàn)代研究表明，決明子具有多種藥理作用[2]，如降血脂[3]、降血壓[4]、抗氧化[5]、保肝[6]及抑菌[7]等。決明子含蒽醌類、萘駢吡喃酮類、脂肪酸類、氨基酸和無機元素等，其主要成分為蒽醌類及萘駢吡喃酮類成分[8]。

炒決明子為決明子的炮制品，決明子炒制后能緩和寒瀉之性，具有平肝養(yǎng)目的功效[8]。生、炒決明子功效各異，主要在于炒制過程中決明子內(nèi)化學成分的含量發(fā)生變化。根據(jù)2015年版《中華人民共和國藥典》，決明子按照清炒法，炒至微鼓起、有香氣[1]即可，但沒有規(guī)定明確的炒制溫度及炒制時間。為探究決明子炒制過程中化學成分變化規(guī)律，并有效地控制生、炒決明子飲片的質(zhì)量，本課題組采用高效液相色譜法對生決明子及其不同炒制程度的炒決明子中11 種化學成分進行含量測定，揭示炒制溫度及炒制時間對決明子中主要成分的影響，尋找決明子在不同炒制溫度及炒制時間下11種成分的含量變化規(guī)律，并為炒決明子質(zhì)量評價及質(zhì)量標準的制定提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Shimadzu LC-20AB 高效液相色譜系統(tǒng)（島津公司，包括在線脫氣機、Prominence SIL-20A 自動進樣器、SPD-M20A 二極管陣列檢測器、CTO-20A 柱溫箱）；Shimadzu LC-20AD高效液相色譜儀（SPD-20A紫外-可見光檢測器，島津LC-Solusion 工作站）；BP121S電子分析天平（梅特勒-托雷多公司）；KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DY-20流水式中藥打粉機（溫嶺市奧力中藥器械有限公司）；YMC-Pack-ODS-A C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料）（YMC Co.Ltd，Japan）；Fluke 62MAX 紅外測溫儀（珠海天創(chuàng)儀器有限公司）。

乙腈、甲醇及無水乙醇均為色譜純，水為超純水，磷酸、甲酸等均為分析純，購自南京維之誠化學試劑有限公司。對照品決明素（批號：170813，純度≥98.0% ）、決明子苷（批號：161215，純度99.0% ）、決明子苷B2（批號：161219，純度98.5% ）、決明子苷C（批號：161215，純度98.8% ）及紅鏈霉素-龍膽二糖苷（批號：170312，純度97.6% ）購自成都昂賽思生物科技有限公司，大黃素（批號：140728，純度98.0% ）、大黃酚（批號：130406，純度98.0% ）、橙黃決明素（批號：170304，純度98.0% ）、大黃素甲醚（批號：131227，純度98.0% ）、黃決明素（批號：170306，純度98.0% ）、美決明子素（批號：170326，純度98.0% ）均購自南京森貝伽生物科技有限公司。

圖1 混合對照品（A）決明子樣品（B）HPLC 色譜圖

決明子飲片（批號：20160608）購自銅陵禾田中藥飲片股份有限公司，產(chǎn)地為河南洛陽，經(jīng)南京海源中藥飲片有限公司丁斐中藥師鑒定，為豆科植物決明Cassia obtusi foliaL．的干燥成熟種子。不同炒制程度的炒決明子飲片于南京海源中藥飲片有限公司實驗室自制，方法如下：稱取6 份決明子飲片，每份200 g，采用紅外測溫儀測定溫度，于140℃熱鍋下藥，不斷翻炒，待藥溫達到140℃開始計時，分別持續(xù)此溫度3、5、8、10、12、15 min，出鍋，制備得到6份140℃不同炒制時間的決明子飲片，上述過程重復3 次，將相同炒制程度下的3份樣品混合。160℃及180℃不同炒制時間的決明子飲片均按此法炒制。制備得到的不同炒制程度的炒決明子飲片表面暗棕色，偶見焦斑，整體顏色隨著炒制溫度升高及炒制時間的延長而加深，均符合2015 版《中華人民共和國藥典》中炒決明子的性狀特征。生決明子及不同炒制程度的炒決明子飲片粉碎，過50目篩。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱YMC-Pack ODS-A C18柱（250×4.6 mm，5 μm）；流動相選用乙腈（A）-0.1% 甲酸水溶液（B）進行梯度洗脫，洗脫程序：0-10 min，15% -25% （A）；10-15 min，25% -26% （A）；15-35 min，26% -26% （A）；35-45 min，26% -45% （A）；45-50 min，45% -45% （A）；50-70 min，45% -55% （A）；70-90 min，55% -85% （A）；90-95 min，85% -100% （A）；95-110 min，100% -15% （A）；110-120 min，15% -15% （A）；流速：0.5 mL·min-1；檢測波長：284 nm；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。混合對照品及決明子的色譜圖（圖1）。

3.2 混合對照品溶液的制備

分別取待測成分的對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，配制成質(zhì)量濃度分別為決明子苷64.80 μg·mL-1，決明子苷B2100.00 μg·mL-1，決明子苷C 99.20 μg·mL-1，紅鏈霉素-龍膽二糖苷131.76 μg·mL-1的苷類混合對照品溶液及濃度分別為決明素10.48 μg·mL-1，黃決明素12.62 μg·mL-1，橙黃決明素26.82 μg·mL-1，美決明子素μg·mL-1，大黃素28.20 μg·mL-1，大黃酚44.00 μg·mL-1，大黃素甲醚13.65 μg·mL-1的苷元類混合對照品溶液，冷藏（4℃），備用。

表1 回歸方程及線性范圍

2.3 供試品溶液的制備

取決明子或炒決明子粉末（50 目）于60℃烘干至恒重，精密稱0.5 g，置于錐形瓶中，加85% 乙醇30 mL，超聲30 min，過濾，取濾液過0.45 μm微孔濾膜，即得供試品溶液，備用。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取混合對照品貯備液，依次稀釋，制備成包括母液在內(nèi)的7 份不同濃度的混合對照品溶液，并按上述色譜條件測定峰面積，以峰面積（Y）對分析物濃度（X）作線性回歸，求回歸方程及線性相關(guān)系數(shù)，結(jié)果（表1）。

2.5 精密度試驗

精密吸取“2.2”項下的混合對照品溶液10 μL，按照“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，結(jié)果顯示：決明子苷、決明子苷B2、決明子苷C、紅鏈霉素-龍膽二糖苷、決明素、黃決明素、橙黃決明素、美決明子素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的峰面積的RSD 分別為2.02% 、1.39% 、0.72% 、1.72% 、1.91% 、1.17% 、1.23% 、2.04% 、0.36% 、0.53% 、0.52% ，表明儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取決明子供試品溶液，分別在0、2、8、16、36、48 h進樣測定，記錄決明子苷、決明子苷B2、決明子苷C、紅鏈霉素-龍膽二糖苷、決明素、黃決明素、橙黃決明素、美決明子素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的峰面積，計算峰面積的RSD 分別為0.39% 、0.92% 、2.28% 、0.50% 、0.20% 、1.02% 、1.21% 、0.63% 、1.72% 、0.48% 、1.77% ，表明供試品溶液48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復性試驗

精密稱取決明子粉末0.5 g，共6 份，分別按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，以“2.1”項下的色譜條件進樣測定。結(jié)果決明子苷、決明子苷B2、決明子苷C、紅鏈霉素-龍膽二糖苷、決明素、黃決明素、橙黃決明素、美決明子素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的RSD分別為0.99% 、1.05% 、2.33% 、0.94% 、0.98% 、1.14% 、1.25% 、0.85% 、1.35% 、1.46% 、1.28% ，表明方法的重復性良好。

2.8 回收率試驗

精密稱取決明子粉末0.25 g，共6 份，精密加入對照品適量（與0.25 g 決明子中各成分含量相當），按“2.3”項下方法制備供試溶液，在上述色譜條件下進樣分析，計算回收率。結(jié)果決明子苷、決明子苷B2、決明子苷C、紅鏈霉素-龍膽二糖苷、決明素、黃決明素、橙黃決明素、美決明子素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均回收率分別為101.44% 、100.66% 、101.33% 、101.15、99.55% 、100.49% 、99.09% 、99.34% 、100.43% ，100.84% 、103.60% ，RSD 分別為2.26% 、2.65% 、2.08% 、1.94% 、2.40% 、2.69% 、2.72% 、2.44% 、2.89% 、1.91% 、1.95% ，表明方法的回收率良好（表3）。

2.9 樣品含量測定

精密稱取決明子及不同炒制程度的炒決明子粉末約0.5 g，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，以“2.1”項下色譜條件進樣測定，按“2.4”項下回歸方程計算決明子苷、決明子苷B2、決明子苷C、紅鏈霉素-龍膽二糖苷、決明素、黃決明素、橙黃決明素、美決明子素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量，結(jié)果（表2、圖2）。

表2 決明子及炒決明子中11個活性成分的含量（mg·g-1，n=3）

由含量測定結(jié)果可知，在決明子炒制過程中決明子苷、決明子苷B2、決明子苷C 及紅鏈霉素-龍膽二糖苷4種苷類成分的含量整體呈下降趨勢，尤其在160℃及180℃炒制溫度下4 種成分的含量下降較為明顯。決明素、黃決明素、橙黃決明素、美決明子素及大黃素5種苷元類成分的含量在決明子不同炒制程度下變化較小，但以180℃炒制時含量略高。大黃酚及大黃素甲醚2 種苷元類成分在決明子炒制過程中變化顯著，且隨著炒制溫度升高，大黃酚及大黃素甲醚的含量也逐漸升高。決明素、黃決明素、橙黃決明素、美決明子素、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚7 種苷元類成分在藥溫為180℃下炒制8 min 時均出現(xiàn)含量突增現(xiàn)象，之后其含量保持平穩(wěn)或緩慢增加。

表3 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）

續(xù)表3

圖2 不同炒制程度下決明子中11種成分變化趨勢圖

縱觀11 種化學成分的變化趨勢，決明子在180℃炒制時，其內(nèi)的11種成分變化較為顯著，其中180℃變炒制8 min是決明子中11種化學成分變化的關(guān)鍵時間點，8 min后11種化學成分的含量則相對穩(wěn)定。

3 討論

2015 版《中華人民共和國藥典》中決明子項下并未對炒決明子的炮制工藝進行量化闡述，僅用“取凈決明子，照清炒法炒至微鼓起、有香氣”表述。本研究在不同炒制溫度（藥溫）及炒制時間下對決明子進行炮制，制備得到18 種不同炒制程度的炒決明子，采用高效液相對其內(nèi)的11種成分進行含量測定，發(fā)現(xiàn)不同炒制程度下的炒決明子中決明子苷、決明子苷B2、決明子苷C、紅鏈霉素-龍膽二糖苷、決明素、黃決明素、橙黃決明素、美決明子素、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚11種成分的含量差異顯著，整體呈現(xiàn)出苷類成分含量下降及苷元類成分含量上升的趨勢，且炒制溫度及炒制時間均可影響炒決明子中11種成分的含量，其中炒制溫度對成分含量的影響較為明顯。此外，有研究發(fā)現(xiàn)決明子中含有糖苷酶，但在炮制過程中糖苷酶并未發(fā)揮作用，而炮制中的高溫條件是造成決明子炮制后苷類成分含量降低、苷元成分含量升高的主要原因，即高溫使苷類成分的苷鍵斷裂產(chǎn)生對應的苷元[9]，此結(jié)果進一步體現(xiàn)在決明子炮制過程中對炒制溫度控制的重要性。

物質(zhì)基礎(chǔ)的變化與中藥的藥效或藥性密切相關(guān)。在決明子炮制過程中，不同的炮制溫度及炮制時間均會導致決明子物質(zhì)基礎(chǔ)的改變，而物質(zhì)基礎(chǔ)不同必然導致藥效差異。既往的生/炒決明子藥效研究中存在炮制增效、炮制減效及炮制后藥效相當?shù)戎T多爭議，本研究在將決明子于140℃、160℃及180℃分別炒制3、5、8、10、12、15 min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以上不同程度的炒決明子均符合2015版《中華人民共和國藥典》規(guī)定的“炒制微鼓起、有香氣”，而檢測結(jié)果顯示不同炒制程度下決明子主要成分存在較大差異，故而考慮既往文獻中藥效爭議可能與研究者采用的炒決明子的炮制程度有關(guān)。在決明子炮制過程中，物質(zhì)基礎(chǔ)的量變可能會引起藥效的質(zhì)變，故炮制過程化學研究對揭示中藥炮制的機制具有重要作用。因此簡單地用“炒制微鼓起、有香氣”對炒決明子的炮制終點進行判斷是不合理的，為規(guī)范炒決明子的炮制工藝及保證炒決明子的質(zhì)量穩(wěn)定，需對炒決明子的炮制過程進行量化，在炒決明子飲片的實際生產(chǎn)中，在固定投料量的基礎(chǔ)上，規(guī)范決明子炒制的溫度及炒制時間。