三七總皂苷紅花提取物復方配伍對心肌缺血及再灌注損傷的保護作用＊

李穎慧，魏 蕓，程文豪，徐婷婷，張碩峰

（北京中醫藥大學中藥學院 北京 100029）

心血管疾病是全球的頭號死因，據WHO 統計2015年全世界約有1770萬人死于心血管疾病，占全球死亡總數的31% 。其中，約有740 萬人死于冠心病[1]。心肌缺血是指心臟的血液灌注減少，導致心臟的供氧減少，心肌能量代謝不正常，從而無法維持心臟正常工作的一種病理狀態，是冠心病等多種心臟疾病的常見癥狀[2]。使用溶栓治療或經皮冠狀動脈介入治療是減少心肌梗死面積并改善臨床癥狀的最有效策略，即通過對缺血的冠狀動脈進行再灌注來治療缺血性心臟病[3]，但這種治療方式所引起的再灌注損傷卻是不能忽視的問題。隨著缺血性心臟病發病率的升高，如何在保證有效治療心肌缺血的同時減輕再灌注損傷也成為了研究的熱點。研究認為心肌缺血再灌注的發生可能與鈣超載、線粒體損傷、氧化應激、炎性反應和細胞凋亡等相關。臨床上治療手段包括藥物預處理、缺血預處理和后處理等[4]。中藥有效成分和復方制劑在心血管疾病的治療上有著較好的效果，中藥多成分多靶點的特性也成為了中藥治療心肌缺血及再灌注損傷的優勢所在，需要對其多靶點作用的機制進行深入探究。

三七總皂苷是三七的主要活性成分，研究顯示三七總皂苷具有抗心肌缺血及再灌注損傷、保護血管內皮細胞、抗血小板異常活化等多種藥理作用[5]。紅花為常用的活血化瘀藥，臨床上多用于治療冠心病、心絞痛、婦科疾病、跌打損傷等[6]。在之前的研究中已證實，三七紅花配伍在改善血液流變學、抗心肌缺血、清除自由基等方面有較好效果[7-9]。重要的是，與三七或紅花單味藥提取物相比，三七紅花復方配伍在抑制缺血誘導的氧化應激和減少心肌梗塞面積方面表現出更顯著的效果[9]。本研究選用冠狀動脈結扎致大鼠心肌缺血模型及心肌缺血1 h再灌注72 h模型，通過檢測心肌梗塞范圍、心肌酶活性、心功能、炎癥因子、病理形態等指標，探討三七紅花配伍復方對心肌缺血及再灌注損傷的保護作用及其潛在的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

健康SD 大鼠，雌雄各半，體質量220-240 g，由北京維通利華實驗動物技術有公司提供。合格證號：11400700113732。

1.2 實驗藥品與試劑

三七總皂苷、紅花提取物：北京大學醫學部姜勇教授提供；通心絡膠囊（批號：A1405019）由石家莊以嶺藥業股份有限公司提供。肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脫氫酶（LDH）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）（批號均為20150110）均由南京建成生物工程研究所提供；大鼠LTB4 酶聯試劑盒（品牌：Bluegene，批號：20151109）；大鼠IL-1b酶聯試劑盒（批號：20151127）、大鼠IL-6 酶聯試劑盒（批號：20151108）、大鼠TNF-α酶聯試劑盒（批號：20151112）、大鼠IL-8 酶聯試劑盒（批號：20151120），品牌均為R&D，進口分裝。

1.3 實驗設備

MedLab-U 多通道生理采集系統：南京美易科技有限公司產品；RM6240C 多通道生理采集系統：成都儀器廠產品；DW3000呼吸機：安徽正華生物儀器設備有限公司產品；MULTISKAN MK3 全自動多功能酶標儀：Thermo，USA；UV-2000紫外分光光度計：上海尤尼柯公司產品。

2 實驗方法

2.1 分組與給藥

2.1.1 心肌缺血模型

大鼠隨機分為6 組：三七紅花復方高、中、低劑量（110、55、27.5 mg·kg-1）組、通心絡膠囊312 mg·kg-1組、模型組、假手術組。于造模前30 min 按劑量分別灌胃給藥一次，造模后6 h再灌胃給藥一次。假手術組、模型組灌胃給予等量飲用水，給藥容積均為1 mL·100 g-1體質量。

2.1.2 心肌缺血再灌注損傷模型

大鼠分組同前。于手術前30 min 灌胃給藥1 次，再灌注后飼養3 d，每天給藥一次，給藥容積均為1 mL·100 g-1。

2.2 造模方法

2.2.1 心肌缺血模型

大鼠灌胃給藥后，用10% 水合氯醛（350 mg·kg-1）腹腔注射麻醉大鼠，經口插氣管，連接呼吸機，呼吸頻率為60 次·min-1，潮氣量為6 mL。于大鼠左側第四肋間開胸，用6/0 手術線在肺動脈圓錐和左心耳交界下緣1-2 mm 結扎，假手術組只在左前降支相應位置穿針而不打結，其余操作與手術組相同。手術后觀察10 min，待呼吸平穩后，擠出胸腔內氣體并逐層關胸，縫合傷口，拔出氣管插管并清除氣管內分泌物，恢復大鼠自主呼吸，給予飼料和水喂養24 h。

2.2.2 心肌缺血再灌注損傷模型

用上述方法對大鼠進行冠脈結扎，缺血1 h后再剪開結扎線恢復血流。造模后，給予飼料和水喂養72 h。

2.3 指標檢測

2.3.1 急性心肌缺血指標檢測

2.3.1.1 心肌梗塞范圍的測定

大鼠造模24 h 后，戊巴比妥鈉50 mg·kg-1腹腔注射麻醉大鼠，取出心臟，用生理鹽水洗凈-20 ℃冷凍10 min。將心臟從結扎線下切成5 份，用1% TTC 磷酸鹽緩沖液在空氣震蕩浴中37 ℃染色，非梗塞區呈鮮紅色，梗塞區呈黃白色。用image-pro 圖像分析軟件分析，計算心肌梗塞體積占心肌總體積的百分比，表示心肌梗塞的范圍。

2.3.1.2 心肌缺血生化指標的測定

大鼠采血后離心10 min（3500 r·min-1），取上清放入-80 ℃冰箱凍存，按試劑盒說明書測定LDH、CKMB、AST活性。

2.3.2 心肌缺血再灌注損傷指標檢測

2.3.2.1 心肌缺血再灌注損傷心功能檢測

再灌72 h 后，戊巴比妥鈉50 mg·kg-1腹腔注射麻醉大鼠，背位固定大鼠，經大鼠右側頸總動脈插管至左心室，連接壓力換能器，使用MedLab-U生物信號采集系統記錄10 min，測定大鼠左心功能。

2.3.2.2 IL-1β、IL-6、IL-8、LT-B4、TNFα含量檢測

左心功能測定完畢后，迅速取出心臟，置于生理鹽水中沖洗，去除心臟內污血以及非心肌組織如血管、脂肪等，取左心室前壁心肌組織勻漿置于-80 ℃冰箱，按試劑盒說明書檢測IL-1β、IL-6、IL-8、LT-B4、TNF-α含量。

2.3.2.3 心肌組織病理學分析

將取下的心肌組織制作成石蠟切片后，HE染色觀察心肌組織的病理性損傷。

2.4 數據分析方法

用SPSS20.0統計軟件處理，組間均數的比較采用t檢驗，對各組數據進行顯著性檢驗。計量資料Xˉ±SD表示。

表1 三七紅花復方對冠脈結扎致心肌缺血大鼠心肌梗塞范圍的影響

表1 三七紅花復方對冠脈結扎致心肌缺血大鼠心肌梗塞范圍的影響

注：與模型組比較*P<0.05，**P<0.01。

3 實驗結果

3.1 三七紅花復方對冠脈結扎致心肌缺血大鼠的作用

結果表明，三七紅花復方各劑量組均可不同程度地減少大鼠心肌梗塞范圍，其中三七紅花復方中、低劑量組的抗心肌梗塞作用與模型組比較，具有統計學差異（P<0.05），結果見表1。

結果表明，各劑量組可不同程度地抑制模型大鼠血清AST、CK-MB、LDH 的升高，其中三七紅花復方高、中、低劑量組對模型大鼠血清AST、LDH 升高的抑制作用與模型組比較具有顯著統計學差異（P<0.01），三七紅花復方中劑量組對模型大鼠血清CK-MB 升高的抑制作用明顯強于模型組（P<0.05），結果見表2。

3.2 三七紅花復方對心肌缺血1 h再灌注72 h 損傷大鼠的影響

結果表明，大鼠心肌缺血1 h 再灌注損傷72 h 后，大鼠心臟左心室收縮功能、舒張功能明顯降低，表現為LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax 明顯低于假手術組（P<0.05）。三七紅花復方各劑量可不同程度抑制模型大鼠左心功能的下降，其中三七紅花復方高、中劑量組作用明顯強于模型組（P<0.05），結果見表3。

結果表明，大鼠心肌缺血1 h再灌注損傷72 h 后，大鼠心肌組織TNF-α、LT-B4 含量顯著高于假手術組（P<0.01）。三七紅花復方各劑量可不同程度抑制模型心肌組織TNF-α、LT-B4含量的升高，其中三七紅花復方高劑量組抑制TNF-α含量升高作用強于模型組（P<0.05），抑制LT-B4含量升高作用顯著強于模型組（P<0.01），結果見表4。

結果表明，大鼠心肌缺血1 h再灌注損傷72 h 后，大鼠心肌組織IL-1β含量高于假手術組（P<0.05）、IL-6 和IL-8 含量明顯高于假手術組（P<0.01）。三七紅花復方各劑量可不同程度抑制大鼠心肌組織IL-1β、IL-6、IL-8含量的升高，其中三七紅花復方高劑量組對IL-1β、IL-6含量升高的抑制作用與模型組相比具有統計學差異（P< 0.05），結果見表5。組織學檢測表明，假手術組大鼠心肌組織結構正常，未見心外膜血管充血，心肌組織細胞排列正常，心肌纖維未見斷裂，心肌細胞未見萎縮、肥大，未見心肌細胞水腫、局部肌凝等變性或壞死性變化，心肌纖維間未見充血、水腫和炎細胞浸潤。模型組大鼠與假手術組對比，大鼠心肌均出現不同程度（梗塞范圍）的缺血缺氧損傷性變化，在左心室前壁、側壁、室間隔部位出現不同程度的大片梗塞區，其中央1/3 區域可見蒼白色出血壞死，周圍2/3 區域可見中性白細胞為主的炎細胞密集浸潤。三七紅花復方的各劑量可明顯減輕缺血再灌注所造成的損傷，不同程度減少大鼠心肌梗塞灶的數量和范圍，在左心室前壁或室間隔部位心肌出現小片梗塞區，梗死區內可見中性白細胞為主的炎細胞浸潤（圖1）。

表2 三七紅花復方對冠脈結扎致心肌缺血大鼠血清AST、CK-MB、LDH活性的影響（

表2 三七紅花復方對冠脈結扎致心肌缺血大鼠血清AST、CK-MB、LDH活性的影響（

注：與模型組比較*P<0.05，**P<0.01。

表3 三七紅花復方對心肌缺血1 h再灌注損傷72 h后大鼠心功能的影響（

表3 三七紅花復方對心肌缺血1 h再灌注損傷72 h后大鼠心功能的影響（

注：與模型組比較*P<0.05，**P<0.01。

表4 三七紅花復方對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織TNF-α、LT-B4的影響（

表4 三七紅花復方對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織TNF-α、LT-B4的影響（

注：與模型組比較*P<0.05，**P<0.01。

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表5 三七紅花復方對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織IL-1β、IL-6、IL-8的影響（

表5 三七紅花復方對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織IL-1β、IL-6、IL-8的影響（

注：與模型組比較*P<0.05，**P<0.01。

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圖1 三七紅花對心肌缺血再灌注損傷保護的病理觀察（HE染色，10×）

4 討論

中醫學認為心肌缺血屬于“胸痹”的范疇，與胸痹最密切相關的病因病機是氣虛和血瘀，治療心肌缺血應該從中醫的角度去辨證論治，活血化瘀是治療心肌缺血主要途徑。三七和紅花為治療心腦血管疾病的常用藥物，三七紅花均為活血化瘀藥。因此，三七紅花配伍治療心肌缺血類疾病符合中醫相須配伍原則。在本課題組前期實驗中，單用60 mg·kg-1三七總皂苷及單用50 mg·kg-1紅花提取物均能縮小急性心肌缺血后心肌梗塞范圍，使用110 mg·kg-1三七紅花復方配伍（三七總皂苷與紅花提取物按6∶5 配伍）能顯著縮小急性心肌缺血后心肌梗塞范圍，提示兩者配伍使用可增強抗心肌缺血的作用。三七和紅花抗心肌缺血的作用既有相同點又各有側重，有研究表明，三七總皂苷可抑制NF-κB 的活性，抑制中性粒細胞活化黏附[10]。紅花通過抑制PAF 與其受體的特異性結合，從而抑制PAF 介導的中性粒細胞的聚集和黏附[11-12]。因此，三七和紅花配伍應用與單用相比，其作用范圍進一步擴大，可有效加強抗心肌缺血及再灌注損傷的作用。

心肌缺血造成心肌組織壞死，心肌酶從心肌細胞漏出，導致血清中各種心肌酶的活性升高，檢測血清中心肌酶活性有助于心肌損傷的快速診斷。肌酸激酶（CK）和肌酸激酶同工酶（CK-MB）在心肌缺血早期即可在血清中檢測出來，特異性和靈敏度較高，可用于急性心肌缺血的早期診斷[13]。天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）和乳酸脫氫酶（LDH）在血清中出現的時間較CK和CK-MB晚，但持續時間長，可以在心肌缺血發生的中后期檢測出來[14]。本研究選擇CK-MB、AST 和LDH 來判斷心肌損傷程度并評估三七紅花復方抗心肌缺血損傷的療效，結果顯示三七紅花復方中、低劑量在造模后24 h 給藥兩次可明顯減少大鼠心臟梗塞范圍，并抑制模型大鼠血清AST、CK-MB、LDH 的升高，表明三七紅花復方對缺血心肌具有保護作用。

當缺血區的血流再次恢復時，再灌注損傷的產生會使得心肌組織損傷程度加深，并將在缺血損傷期處于可逆損傷的心肌細胞轉化為不可逆損傷細胞[15]。心肌缺血及再灌注會損害左心室收縮和舒張功能，引起一系列血流動力學變化，如心肌收縮力和順應性降低，每搏輸出量減少和左心室舒張末期壓力增加[16]。左心室內壓最大下降速率（-dp/dtmax），主要反映左心室的舒張功能；左心室收縮壓（LVSP）、左心室內壓最大上升速率（+dp/dtmax），主要反映左心室的收縮功能，表現為LVSP 越高，左心室收縮力越好。檢測心肌缺血再灌注損傷大鼠的心功能可顯示LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax 明顯降低[17]。三七紅花復方各劑量可不同程度抑制模型大鼠左心功能的下降，其中高、中劑量組可明顯改善大鼠心臟收縮與舒張功能。

隨著近年對心肌缺血再灌注損傷機制的深入研究，過度的炎癥反應被認為是心肌缺血再灌注損傷的主要機制之一。由于心肌組織損傷和組織壞死，病變心肌中可見中性粒細胞、單核細胞或巨噬細胞浸潤，此時血清中各種炎癥性細胞因子水平升高，如白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）、白三烯（LT-B4）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥標志物[18]，這些炎性細胞因子的動態變化和濃度還可能與組織損傷的時間及程度相關[18]，同時阻斷炎癥通路也為心肌缺血及再灌注的治療提供了思路[19-21]。本研究以炎性因子作為評價心肌缺血再灌注損傷的指標，來綜合評價三七紅花復方抗心肌缺血再灌注損傷的作用。結果顯示，三七紅花復方高劑量組可明顯抑制模型大鼠心肌TNF-α、LT-B4、IL-1β、IL-6 的升高。病理結果顯示，三七紅花復方各劑量組與模型組比較心肌的梗死灶的范圍明顯變小。表明三七紅花復方可抑制心肌缺血與再灌注損傷所引起的炎癥反應，對心肌缺血再灌注損傷心肌具有保護作用。

綜上所述，三七紅花復方對心肌缺血和心肌缺血再灌注損傷均可起到一定的保護作用，其保護機制可能與抗炎癥反應有關，為三七紅花復方配伍治療缺血性心臟病提供了理論依據。但是結果也顯示出三七紅花復方治療心肌缺血及再灌注損傷時量效關系并不明顯，對心肌缺血有顯著改善效果的劑量在作用于缺血再灌注損傷時部分指標沒有得到顯著的改善，分析可能與再灌注造成的心肌損傷加重或中藥量效關系的復雜性有關，單味藥的有效劑量在復方中受到配伍藥物的影響可能會出現作用減弱的情況[22]，因此對于三七紅花復方作用于心肌缺血/再灌注損傷的最佳劑量還需要深入探究。另外，可以通過監測三七紅花復方對心肌缺血及再灌注損傷作用的動態變化，來探究該復方對心肌缺血及再灌注不同損傷時間和程度的作用效果，為臨床的合理應用提供更多依據。

5 結論

三七紅花復方可抑制大鼠心肌缺血與再灌注損傷所引起的炎癥反應，改善其心功能，提示該復方對于人體心肌缺血及再灌注損傷可能具有保護作用，本研究以期為臨床應用提供藥理學依據。