基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)的中藥地榆活性成分及藥理作用研究＊

李 娃，楊春娟，成聰聰，張唯佳，彭 昶，袁月梅，姚美村＊＊

（1.中山大學(xué)藥學(xué)院 廣州 510000;2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 哈爾濱 150081；3.沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院 沈陽 110016）

地榆（Sanguisorbae Radix）是薔薇科植物，以干燥根入藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性微寒，味苦、澀、酸，歸肝和大腸經(jīng)，有涼血止血、清熱解毒、消腫斂瘡等功效?，F(xiàn)代化學(xué)成分研究表明，地榆含有較多的鞣質(zhì)類成分，包括地榆素、鞣花酸、沒食子酸、兒茶素等，還含有其特有成分地榆皂苷Ⅰ、地榆皂苷Ⅱ等。而藥理研究表明，地榆有抗炎[1,2]、抗菌[3]、止血、抗氧化[4]、抗腫瘤[5]等藥理作用，是臨床常用于化療后升白及治療痔瘡的重要藥物。我們在進(jìn)行地榆相關(guān)研究時，發(fā)現(xiàn)其具有明顯的免疫增強(qiáng)作用[2]，如對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖具有抑制作用[6]，對Wnt/β-catenin 信號通路有明顯的下調(diào)作用[7]，以及對結(jié)核分枝桿菌和耐藥金黃色葡萄球菌具有明顯抑制作用等，這提示地榆具有廣泛的、多方面的藥理活性。這些研究有助于認(rèn)識地榆的藥效活性，但仍不能深層次的揭示產(chǎn)生這些活性的作用機(jī)制。

隨著生物科學(xué)和信息技術(shù)的飛速發(fā)展，人們對生命科學(xué)的研究已經(jīng)從單一分子轉(zhuǎn)向多分子之間的相互作用及這種相互作用所構(gòu)成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)上，特別是對于多成分、多靶點(diǎn)和多途徑的中藥來說更是如此。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為研究這種復(fù)雜作用網(wǎng)絡(luò)最主要的方法和手段，在中藥物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制方面起到了非常重要的作用[8,9]。在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析中，研究者結(jié)合多個數(shù)據(jù)庫軟件，針對藥物成分、靶點(diǎn)、疾病之間的關(guān)系進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘和整合分析[10]，可直觀、高效地展示藥物與機(jī)體之間的相互作用，并預(yù)測產(chǎn)生這種相互作用潛在的規(guī)律及機(jī)制。“中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)”促進(jìn)了中醫(yī)學(xué)中的中藥研究從“單一靶標(biāo)、單一藥物”向“網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)、多成分藥物”模式的轉(zhuǎn)變。同時，一系列中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法得以創(chuàng)建，使中醫(yī)學(xué)從基于經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)學(xué)邁向了基于證據(jù)的醫(yī)學(xué)，并加快了中藥藥物的發(fā)現(xiàn)，改進(jìn)了藥物研究策略[11,12]。尤其在中藥方劑復(fù)雜化學(xué)體系與病證復(fù)雜生物系統(tǒng)的相互作用研究中提出了“網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)”這一新的思路與方法。通過將病證、方藥映射于生物分子網(wǎng)絡(luò)，并在網(wǎng)絡(luò)上對病證與方藥的關(guān)系進(jìn)行機(jī)制性計算、分析、預(yù)測，來發(fā)現(xiàn)藥效物質(zhì)及作用機(jī)制，方劑配伍規(guī)律等[13]。

本研究將應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法和手段進(jìn)行地榆作用機(jī)制的探討。通過數(shù)據(jù)庫搜索出地榆活性成分對應(yīng)靶點(diǎn)和信號通路，再應(yīng)用多種數(shù)據(jù)分析軟件，構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路的網(wǎng)絡(luò)模型，分析地榆多種藥理活性的潛在機(jī)制，并預(yù)測其新的活性，為地榆的深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 地榆化學(xué)成分的收集及靶點(diǎn)預(yù)測

以地榆為關(guān)鍵詞在Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology（TCMSP）數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行成分與對應(yīng)靶點(diǎn)的查詢以及篩選，并根據(jù)Uniprot 數(shù)據(jù)庫（http://www.uniprot.org/）查詢靶點(diǎn)蛋白所對應(yīng)的基因名稱。TCMSP 數(shù)據(jù)庫是針對《中國人民共和國藥典》中的每味中藥，利用人工在互聯(lián)網(wǎng)上查詢與每味中藥相關(guān)的已發(fā)表文獻(xiàn)和書籍，并參考了國內(nèi)外廣泛使用的中藥數(shù) 據(jù) 庫，如：TCMDatabase@Taiwan，TCMID，Chem-TCM，TCM-ID，HIT等，獲取到了每味中藥可靠的成分信息[14]。

1.2 靶點(diǎn)分類富集分析

Biological Networks Gene Ontologutool（BiNGO）分析工具將Gene Ontology（GO）數(shù)據(jù)庫與Cytoscape 軟件連接并對基因進(jìn)行可視化注釋分析。將靶點(diǎn)基因?qū)朐摂?shù)據(jù)庫，以P<0.05 為顯著性閾值，進(jìn)行GO 生物學(xué)過程與分子功能分類富集分析。

1.3 通路富集分析

采用The Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery（DAVID）數(shù)據(jù)庫，對靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路分析，并在KEGG 數(shù)據(jù)庫中對富集通路進(jìn)行注釋和分析。

1.4 地榆傳統(tǒng)活性作用機(jī)制分析

利用NCBI Gene（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫檢索人源的抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、止血相關(guān)基因。將各種活性的相關(guān)基因與地榆成分對應(yīng)靶基因進(jìn)行相互映射，相互映射所得的基因再根據(jù)DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG 通路富集分析，分析地榆傳統(tǒng)生物活性的靶點(diǎn)和作用機(jī)制。

1.5 地榆成分-靶點(diǎn)-通路可視化網(wǎng)絡(luò)互作分析

將相應(yīng)的成分、靶點(diǎn)、通路導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建成分-靶點(diǎn)，靶點(diǎn)-通路，成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 地榆主要化學(xué)成分

根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫收集到35個化學(xué)成分，包括最常見的沒食子酸、兒茶素、鞣花酸等鞣質(zhì)類成分以及地榆皂苷（表1）。

2.2 潛在靶點(diǎn)預(yù)測

通過數(shù)據(jù)庫分析，發(fā)現(xiàn)地榆中有20個化學(xué)成分涉及到230個靶點(diǎn)蛋白（共339次），出現(xiàn)頻次較多的靶點(diǎn)蛋白（表2）。

從結(jié)果可知前列腺素G/H 合成酶1（Prostaglandin G/H synthase 1，P23219）、前 列腺 素G/H 合 成 酶2(Prostaglandin G/H synthase 2，P35354）、熱休克蛋白90α（Heat shock protein HSP 90 alpha，P07900）、孕激素受體蛋白（Progesterone receptor，P06401）、細(xì)胞核受體共激活劑（Nuclear receptor coactivator 2，Q15596）、磷脂聯(lián) 脂 醇- 4,5- 二 磷 酸 三 激 酶 催 化 亞 基,γ 異 型（Phosphatidylinositol- 4,5- bisphosphate 3- kinase catalytic subunit,gamma isoform，P48736）等靶點(diǎn)出現(xiàn)的頻率較高。

2.3 Gene Ontology分析

GO分析是對基因在生物過程、分子功能等方面分類富集的注釋，其中P值的大小體現(xiàn)了蛋白質(zhì)群與生物學(xué)功能的相關(guān)程度。地榆化學(xué)成分的GO生物過程與分子功能富集顯著性前十的分析結(jié)果見圖1。由結(jié)果可知，靶點(diǎn)蛋白參與的生物學(xué)過程有RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄過程、細(xì)胞增殖過程、炎癥過程、血管生成等，表明了地榆中的化學(xué)成分參與了體內(nèi)多種生物學(xué)過程。同時，靶點(diǎn)蛋白參與了特異性DNA序列結(jié)合、蛋白質(zhì)二聚體結(jié)合作用、血紅素結(jié)合作用、細(xì)胞因子活性、類固醇激素受體作用等分子功能，表明地榆對生物體內(nèi)的多種分子功能具有一定的影響。

2.4 地榆化學(xué)成分潛在靶點(diǎn)通路預(yù)測

將230 個靶點(diǎn)輸入DAVID 分析軟件，進(jìn)行KEGG通路分析，根據(jù)P<0.05 篩選共獲得118 條重要通路，利用KEGG數(shù)據(jù)庫對篩選出的通路進(jìn)行注釋分析。結(jié)果表明，與人類疾病相關(guān)的通路有52條，包括癌癥、炎癥、內(nèi)分泌代謝疾病、神經(jīng)變性疾病、免疫疾病等。與信號傳導(dǎo)有關(guān)的通路有20條，與免疫系統(tǒng)相關(guān)的通路14 條，與內(nèi)分泌系統(tǒng)相關(guān)的通路有10 條，與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)通路7條，與細(xì)胞內(nèi)生物過程相關(guān)通路7條等。其中根據(jù)P值大小排名前20的通路結(jié)果見表2。在臨床研究中，劉純一等人[15]在地榆升白片聯(lián)合重組人粒細(xì)胞刺激因子治療癌癥相關(guān)性乏力研究中發(fā)現(xiàn)地榆升白片聯(lián)合重組人粒細(xì)胞集落刺激因子能夠改善腫瘤患者在化療期間的白細(xì)胞減少和疲勞癥狀。程林忠等人[16]也發(fā)現(xiàn)地榆升白片加Vit B4能較好的防止放療引起的骨髓抑制，維持白細(xì)胞穩(wěn)定。王燕玲[17]通過臨床觀察發(fā)現(xiàn)包含地榆的肛瘺愈創(chuàng)洗液對胃腸道慢性炎癥肉芽腫性疾病克羅恩病有良好的治療作用。

表1 地榆中主要化學(xué)成分

表2 地榆化學(xué)成分的潛在靶點(diǎn)信息

2.5 地榆化學(xué)成分-靶點(diǎn)-通路可視化互作網(wǎng)絡(luò)

應(yīng)用Cytoscape 軟件構(gòu)建地榆化學(xué)成分與靶點(diǎn)蛋白，靶點(diǎn)蛋白與通路網(wǎng)絡(luò)，20 個化學(xué)成分，230 個靶點(diǎn)以及118 條通路之間相互網(wǎng)絡(luò)關(guān)系見圖2、圖3。由圖可見，地榆化學(xué)成分與靶點(diǎn)蛋白，靶點(diǎn)蛋白與信號通路存在復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，地榆成分通過不同的靶點(diǎn)蛋白在多個通路中發(fā)揮作用。其中，我們以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了TCF/LEF序列的NIH3T3細(xì)胞為模型，利用熒光報告基因系統(tǒng)驗(yàn)證了地榆對根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測出的Wnt通路的影響，發(fā)現(xiàn)地榆能夠抑制Wnt通路，并對該通路上的關(guān)鍵蛋白β-catenin的表達(dá)明顯下調(diào)，結(jié)果見圖4。

2.6 地榆傳統(tǒng)活性的成分-靶點(diǎn)蛋白-通路網(wǎng)絡(luò)

將地榆的傳統(tǒng)活性抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、止血作用的相關(guān)基因與地榆化學(xué)成分對應(yīng)的靶點(diǎn)相映射，得到與抗炎相關(guān)的靶點(diǎn)23個，抗菌相關(guān)靶點(diǎn)10個，抗氧化相關(guān)靶點(diǎn)50個，抗腫瘤相關(guān)靶點(diǎn)52個，止血相關(guān)靶點(diǎn)9個。再將這些靶點(diǎn)依次輸入DAVID軟件進(jìn)行KEGG 分析，根據(jù)P<0.05 對通路進(jìn)行篩選，最后再利用Cytoscape軟件構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測地榆傳統(tǒng)活性的潛在機(jī)制。以抗腫瘤活性為例其可視化網(wǎng)絡(luò)圖見圖5。

3 討論

本論文應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，對傳統(tǒng)中藥地榆的活性成分[18]進(jìn)行了靶點(diǎn)預(yù)測和網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，探索了地榆的活性成分、靶點(diǎn)蛋白、信號通路3種節(jié)點(diǎn)之間的網(wǎng)絡(luò)特征。從結(jié)果可以看出，地榆的20個成分主要通過P23219、P35354、P07900、Q15596、P48736 等蛋白發(fā)揮生物作用，說明這些蛋白有可能是地榆成分的主要潛在作用靶點(diǎn)。通過對118 條通路的分析可知，癌癥通路、乙型肝炎通路、前列腺癌通路、胰腺癌通路以及HIF-1信號通路是地榆化學(xué)成分發(fā)揮生物效用的主要信號通路。

圖1 地榆成分的GO生物學(xué)分析

表3 地榆主要的成分潛在作用通路預(yù)測

圖2 地榆成分-靶點(diǎn)蛋白網(wǎng)絡(luò)

圖3 地榆成分的靶點(diǎn)蛋白-信號通路網(wǎng)絡(luò)

圖4 地榆對Wnt通路及其關(guān)鍵蛋白的影響

通過地榆傳統(tǒng)活性作用成分-靶點(diǎn)蛋白-信號通路網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，抗腫瘤、抗氧化作用可能是地榆成分最主要的兩個活性，其中抗腫瘤作用涉及到的癌癥有前列腺癌、胰腺癌、肝癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌等。同時，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果可知，凋亡調(diào)控因子BAX(Q07812)、凋亡調(diào)節(jié)因子Bcl-2（P10415）、轉(zhuǎn)錄因子AP-1（P05412）、轉(zhuǎn)錄因子p65（Q04206）、細(xì)胞分裂蛋白激酶2（P24941）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1（P38936）、NF-κB 激酶亞單位α抑制劑(O15111)等靶點(diǎn)蛋白在癌癥信號通路中發(fā)揮著重要作用，并且地榆中的槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇是影響這些靶點(diǎn)的主要成分，這對研究地榆中化學(xué)成分抗腫瘤作用的作用靶點(diǎn)及機(jī)制探討具有重要的指導(dǎo)意義。最新研究中，Goun 等人[19]發(fā)現(xiàn)地榆能夠明顯抑制白血病大鼠白細(xì)胞的增殖作用。Shin,J.A.等人[20]研究了地榆對人源的口腔癌細(xì)胞HSC4、HN22，Mazzio，E. A.和Soliman，K.F.研究了對宮頸癌細(xì)胞Hela[21]、Choi,E.S.研究了對前列腺癌細(xì)胞PC3[22]均有一定的增殖抑制效果。王志宇等人[23]研究了地榆水提物對乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231的增殖起到抑制作用，且該抑制作用可能與地榆阻滯細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡等因素密切相關(guān)。地榆中的鞣質(zhì)類成分沒食子酸和鞣花酸[23]可能是抗乳腺癌細(xì)胞增殖的主要活性成分，皂苷類成分在抗乳腺癌細(xì)胞增殖作用上也有一定的效果，其主要是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡或激活ROS/JNK 通路等多種途徑發(fā)揮抗乳腺癌作用[24,25]。這些有關(guān)地榆對癌細(xì)胞研究的報道與我們通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析的結(jié)果基本相符。

在抗氧化作用方面，PI3K-Akt signaling pathway、HTLV-I infection、Focal adhesion、Sphingolipid signaling pathway 信號通路的節(jié)點(diǎn)度數(shù)較高。Wen,H.等[26]發(fā)現(xiàn)二苯乙烯類化合物能夠通過PI3K-Akt 通路對大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元起到抗氧化作用。Zhou, X.等[27]研究表明PI3K/Akt依賴性激活Nrf2對大鼠左心室重構(gòu)發(fā)揮抗氧化作用，說明PI3K-Akt 信號通路與抗氧化作用密切相關(guān)。且地榆中槲皮素所對應(yīng)的P31749、P48736、Q04206、P01375、P04637 靶點(diǎn)蛋白節(jié)點(diǎn)度數(shù)較高可能是發(fā)揮抗氧化作用的主要靶點(diǎn)。相關(guān)研究報道表明，通過大孔樹脂柱分離獲得的地榆多酚對羥自由基和DPPH自由基具有較強(qiáng)的抑制作用從而起到抗氧化效果[28]，地榆鞣質(zhì)能夠提高D-型乳糖衰老大鼠的抗氧化能力，其可能與地榆鞣質(zhì)抑制大鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物的生成、抗氧化酶活性的提高有關(guān)[29]，同時，地榆提取物對加速老化小鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)存在影響，能有效減緩小鼠的衰老過程[30]，這些研究結(jié)論部分驗(yàn)證了地榆抗氧化作用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測結(jié)果。

本研究通過地榆化學(xué)成分的潛在靶點(diǎn)預(yù)測、通路分析和地榆化學(xué)成分-靶點(diǎn)-信號通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，揭示了地榆中化學(xué)成分在癌癥、炎癥、內(nèi)分泌代謝疾病、神經(jīng)變性疾病、免疫疾病等疾病的治療具有一定療效，以期為研究地榆多種藥理活性及其作用機(jī)制分析提供參考。