基于HPLC-Q-TOF/MS 法分析馬兜鈴水煎劑化學成分的研究＊

尹 浩，陳爍吉，田小亭，龔祝南

（1.南京師范大學生命科學學院新藥研發中心 南京 210046；2.中國科學院上海藥物研究所 上海 201203）

馬兜鈴首載于《藥性論》，《中華人民共和國藥典》（2015 年版）收載其為馬兜鈴科植物北馬兜鈴Aristolochia contortaBge.或馬兜鈴Aristolochia debilisSieb.et Zucc.的干燥成熟果實。主要含有馬兜鈴酸類成分（主要為馬兜鈴酸I 及馬兜鈴酸II）和馬兜鈴內酰胺類成分，已被大量研究證實其具有腎毒性、致癌和致突變的毒副作用[1-3]。近年來，含馬兜鈴酸的中草藥引起腎損害和癌癥的相關文獻報道較多[4-6]，其中2017年中國臺灣和新加坡學者發表的“馬兜鈴酸及其衍生物與臺灣及整個亞洲的肝癌患者廣泛相關”的文章在中醫藥界引起了較大的影響[7]。

目前對馬兜鈴藥材的研究主要集中在定量分析馬兜鈴“甲醇提取物”中馬兜鈴酸I-IV的含量[8-13]，卻未有文獻報道用質譜分析鑒定馬兜鈴“水煎劑”中的化學成分。因此，本研究首次采用高分辨質譜HPLC-Q-TOF/MS鑒定及半定量分析馬兜鈴“水煎劑”的化學成分，為后續馬兜鈴的毒性研究提供化學物質基礎。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Aglient 1260 系列高效液相色譜（美國安捷倫公司）與帶有雙噴Jet stream 離子源的Agilent 6530 四級桿飛行時間（Q-TOF）質譜儀（美國安捷倫公司）聯用；XS105DU 分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；Millipore Milli-Q純水器（美國Millipore公司）；乙腈（質譜純，Fisher公司）；甲酸（HPLC級，國藥集團化學試劑有限公司）。

圖1 馬兜鈴內酰胺I（A）和馬兜鈴酸I（B）的提取離子流圖及多級質譜圖

馬兜鈴藥材購于上海康橋藥業有限公司，經中國科學院上海藥物研究所李志雄老師鑒定為馬兜鈴科植物馬兜鈴Aristolochia debilisSieb. et Zucc.的干燥成熟果實。馬兜鈴酸I（AAI）購于成都領航者生物技術有限公司，馬兜鈴內酰胺I（ALI）購于上海源葉生物科技有限公司，純度大于等于98% 。

1.2 實驗方法

1.1.1 色譜條件

色譜條件：色譜柱ACE Excel C18柱（100 mm×2.1 mm，3.0 μm）；柱溫40℃，流速0.35 mL/min；進樣量：10 μL；流動相：0.1% 甲酸水溶液（A），0.1% 甲酸乙腈溶液（B）；梯度洗脫條件：0-18 min（5% -95% B），18-20.5 min（95% -95% B），20.5-21 min（95% -5% B），21-25 min（5% -5% B）。

1.1.2 質譜條件

ESI離子源，質譜在正離子模式下檢測，質譜參數優化結果如下：八級桿電壓，65 V；毛細管電壓，4 KV；毛細管出口電壓，100 V；噴嘴電壓，500 V；霧化氣壓力，35 psi；氮氣流速，5 L/min；氮氣溫度300℃；鞘氣流速，11 L/min；鞘氣溫度，350℃。數據采集使用auto MS/MS掃描方式，每一級質譜自動選擇基峰離子作為下一級質譜的母離子進行碎裂；數據定性分析采用Agilent Technologies Masshunter Workstation Qualitative Analysis Software(Version.B.06.00)。

1.1.3 供試品溶液制備

取馬兜鈴藥材100 g，加入2 L水，加熱回流2 h，過濾得到濾液。藥材中再加入1 L水，加熱回流2 h，合并兩次濾液，濃縮至100 mL。得1 g·mL-1馬兜鈴水煎劑，用95% 水（5% 乙腈）稀釋100 倍，平行稀釋3 份，渦旋，14000 rpm 4℃離心10 min，取上清液，即得供試品溶液。

1.1.4 對照品溶液的制備

取對照品馬兜鈴酸I和馬兜鈴內酰胺I各2 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中加甲醇溶解，定容，搖勻，即得對照品溶液。

2 結果與分析

2.1 馬兜鈴水煎劑中化合物鑒定分析

Q-TOF-MS/MS 條件按照1.2.2 節方法進行了優化，按照上述的分析條件，馬兜鈴水煎劑中的化學成分可獲得較好的分離與檢測。首先，采用現有對照品馬兜鈴酸I 和馬兜鈴內酰胺I 對其高分辨質譜裂解規律進行解析。如圖1所示，馬兜鈴內酰胺I的保留時間為12.86 min，馬兜鈴酸I 的保留時間為13.96 min。圖2(A)所示，馬兜鈴內酰胺I 的準分子離子峰為m/z294.0753[M+H]+，在二級質譜中，該離子相繼丟失CH3·和CO 形成碎片離子m/z279.0521 和m/z251.0582。圖2（B）所示，馬兜鈴酸I的準分子離子峰為m/z359.0891[M+NH4]+，在二級質譜中，該離子先丟失NH3生成碎片離子m/z342.0571，進而碎片離子m/z342.0571 再分別丟失H2O，CO2和NO2生成碎片離子m/z324.0502，m/z298.0708和m/z296.0676。馬兜鈴內酰胺I和馬兜鈴酸I的質譜裂解途徑如圖2所示。

根據對照品馬兜鈴內酰胺I 和馬兜鈴酸I 的色譜保留時間和質譜信息，可以確定馬兜鈴水煎劑中化合物17和18分別是馬兜鈴內酰胺I和馬兜鈴酸I。由馬兜鈴內酰胺I 和馬兜鈴酸I 的質譜裂解規律推測馬兜鈴水煎劑中具有相同骨架結構的其它馬兜鈴酸和馬兜內酰胺類成分，并結合各化合物的保留時間，精確分子量（誤差在5 ppm 以內），二級碎片裂解信息及相關文獻比對[14-17]，從而對馬兜鈴水煎劑中化學成分進行確認，共推測出18 個化學成分，其中6 個馬兜鈴酸類成分、7 個馬兜鈴內酰胺類成分、1 個生物堿類成分、2 個苯丙烯酸類成分，2個醌類成分（見表1）。

表1 馬兜鈴水煎劑中的主要化學成分

2.2 馬兜鈴酸和馬兜鈴內酰胺類成分的半定量分析

采用高分辨質譜積分峰面積對馬兜鈴水煎劑中6個馬兜鈴酸類成分和7個馬兜鈴內酰胺類成分進行半定量分析（圖3）。質譜峰面積最高的的馬兜鈴酸類成分是馬兜鈴酸I，其余馬兜鈴酸類成分16,14,12,8,13的峰面積依次約為馬兜鈴酸I 的53.2% ，50.7% ，25.9% ，9.9% 和7.7% ；峰面積僅次于馬兜鈴酸I 的是馬兜鈴內酰胺III，其余6 個馬兜鈴內酰胺類成分10,15,17,7,9,4的峰面積依次為馬兜鈴內酰胺III 的77.4% ，61.8% ，57.9% ，23.6% ，17.6% ，16.6% 。其中，馬兜鈴酸類物質的總峰面積是馬兜鈴內酰胺類成分的1.23 倍，這表明馬兜鈴內酰胺類成分的含量在馬兜鈴藥材中可能不容忽略。

圖2 馬兜鈴內酰胺I（A）和馬兜鈴酸I（B）的質譜裂解途徑

圖3 HPLC-Q-TOF/MS檢測馬兜鈴水煎劑（0.01 g?mL-1）中馬兜鈴內酰胺（A）和馬兜鈴酸（B）類成分峰面積及其化學結構

3 討論

目前文獻主要針對馬兜鈴甲醇提取液中馬兜鈴酸I 的定量檢測[18]，而馬兜鈴藥材的傳統用法是水煎，但至今尚未有文獻用質譜分析鑒定馬兜鈴水煎劑中化學成分，這導致無法全面認識馬兜鈴水煎劑的毒效物質基礎。本實驗在分析鑒定馬兜鈴水煎劑中馬兜鈴酸類和馬兜鈴內酰胺類化學成分時，馬兜鈴酸I 和馬兜鈴內酰胺I是通過對比標準品的色譜保留時間和質譜信息確定其化學結構。鑒于馬兜鈴酸類成分與馬兜鈴酸I，馬兜鈴內酰胺類成分與馬兜鈴內酰胺I 具有同樣的化學結構骨架，這表示這些化合物會有類似的質譜裂解規律。因此，通過高分辨質譜HPLC-Q-TOF/MS 提供的馬兜鈴酸I和馬兜鈴內酰胺I的二級碎片離子，可以推測出馬兜鈴酸類和馬兜鈴內酰胺類化學結構的質譜裂解規律，并在此基礎上，結合文獻中報道的馬兜鈴科藥材植化分離的化學成分，通過高分辨質譜提供的質譜信息，推測出馬兜鈴水煎劑中含有6 個馬兜鈴酸類成分和7個馬兜鈴內酰胺類成分。

由于除了馬兜鈴酸I和馬兜鈴內酰胺I，其他成分無法獲得對照品，因此我們通過質譜峰面積法對這13個化合物進行了半定量分析，以便于初步了解馬兜鈴水煎劑中化學成分的含量。在接下來的工作中，我們將會根據本次實驗中這些成分的半定量結果，有針對性的分離馬兜鈴水煎劑中馬兜鈴酸和馬兜鈴內酰胺類成分，并通過質譜、核磁等波譜技術明確其化學結構，并將分離純化得到的化合物作為標準品，對不同批次的馬兜鈴水煎劑中這些成分進行絕對含量測定，并且對這些成分進行體內外毒性篩選，明確闡明馬兜鈴水煎劑的毒性物質基礎。

4 總結

本實驗運用HPLC-Q-TOF/MS 技術對馬兜鈴水煎劑的化學成分進行了研究，通過高分辨質譜提供的準確分子量及碎片裂解信息，分析了馬兜鈴酸和馬兜鈴內酰胺類成分代表化合物馬兜鈴酸I 和馬兜鈴內酰I的質譜裂解規律，并且在馬兜鈴水煎劑中分析鑒定出18個化學成分，其中主要為馬兜鈴酸類和馬兜鈴內酰胺類成分（共13 個）。目前從天然植物中至少分離得到178 種馬兜鈴酸類物質，其中77種有體內毒性的相關報道[5]。馬兜鈴酸I和馬兜鈴酸II被認為是馬兜鈴屬植物致癌和腎臟毒性的主要化學成分[19-21]，其產生毒性的原因是可以在體內代謝生成毒性代謝產物馬兜鈴內酰胺I和馬兜鈴內酰胺II[22]。

鑒于本實驗在馬兜鈴水煎劑中不僅檢測到了馬兜鈴酸I和II，而且在馬兜鈴水煎劑中直接檢測到了馬兜鈴內酰胺I 和II。說明馬兜鈴屬植物致癌和腎臟毒性的化學成分可能并不只是文獻中報道的馬兜鈴酸I和II及其代謝生成的馬兜鈴內酰胺I和II，還有可能是由馬兜鈴水煎劑中馬兜鈴內酰胺I和II直接吸收進入體內導致造成的。同時，除了上述4個成分，我們還在馬兜鈴水煎劑中檢測到了其它4 個馬兜鈴酸類成分及5個馬兜鈴內酰胺類成分，這些成分非常可能在動物口服馬兜鈴水煎劑后直接吸收或者代謝成有毒性的馬兜鈴內酰胺類成分。這提示我們在今后馬兜鈴屬藥材的毒性研究中，不應只關注馬兜鈴酸I 和II，還應關注馬兜鈴中其它馬兜鈴酸和馬兜鈴內酰胺類成分與其肝腎毒性的關系。

因此，本實驗首次用高分辨質譜分析鑒定了馬兜鈴水煎劑中的馬兜鈴酸類和馬兜鈴內酰胺類成分，可為下一步馬兜鈴水煎劑成分的植化分離和毒性篩選提供借鑒。