馬兜鈴酸IVa與2′-脫氧核苷體外反應形成加合物的LC-MS/MS 研究＊

萬晶晶，陳瑞雪，奚 晶,3，曹易懿,3，楊 洲，謝天培，張新宇,3＊＊，欒 洋,3＊＊

（1.上海交通大學醫學院/公共衛生學院 上海 200025；2.上海詩丹德標準技術服務有限公司 上海 201203；3.中藥安全性研究聯合實驗室 上海 200025）

馬兜鈴酸（aristolochic acids）是一類天然化合物的統稱，主要存在于馬兜鈴屬植物中[1]，其結構特征是具有1個硝基菲甲酸的母核。目前已經發現了20余種這一類的化合物，其中馬兜鈴酸I和馬兜鈴酸II是大多數植物中含量最高的化合物[2,3]，其結構如圖1 所示。自然界中含有馬兜鈴酸的植物達600余種，其中60 余種為藥用植物[4,5]。國家食品藥品監督管理總局2017 年10 月30 日發布的可能含有馬兜鈴酸的馬兜鈴科藥材有24種[6]，常見的有朱砂蓮、天仙藤、馬兜鈴和細辛等。

圖1 3種典型的馬兜鈴酸化合物結構（環系編號如環內數字所示）

圖2 馬兜鈴酸I/II的代謝活化以及DNA加合物形成過程

由于馬兜鈴酸I 和馬兜鈴酸II 可引起嚴重的腎病以及腎臟和泌尿系統癌癥，因此引起廣泛關注[7,8]。上世紀中葉發現1 種地方性腎病，稱為巴爾干腎病（Balkan endemic nephropathy），主要表現為腎間質纖維化和慢性腎衰合并上尿路上皮癌（urothelial carcinoma of the upper urinary tract），后來發現其病因是誤服了1種含有馬兜鈴酸的馬兜鈴屬植物[8]。上世紀90 年代，比利時一家減肥診所誤用1 種馬兜鈴屬中草藥廣防己，導致100多名婦女患病，主要表現為迅速進展的腎間質纖維化、腎功能衰竭以及上尿路上皮癌，被稱為中草藥腎病（Chinese herb nephropathy）[9]。由于含有馬兜鈴酸的馬兜鈴屬植物是巴爾干腎病和中草藥腎病的共同病因，因此二者被合并稱為馬兜鈴酸腎病（aristolochic acid nephropathy）[10,11]。2012 年國際癌癥研究中心（International Agency for Research on Cancer）將馬兜鈴酸I/II列為人類致癌物（Group 1）[12]。美國、英國、德國、澳大利亞和加拿大等國家已禁用了馬兜鈴物種（species ofAristolochia）中草藥[2]，我國則取消了廣防己、青木香和關木通3種藥材的使用[6]。

目前一般認為馬兜鈴酸I 和馬兜鈴酸II 致癌性由其本身與代謝活化2 種方式引起（圖2）[1,7]。在代謝活化方式中，這些化合物分子中的硝基首先經過酶的部分還原形成羥胺，隨即與羧基反應形成N-羥基馬兜鈴內酰胺，再經酶的轉化產生活性中間體馬兜鈴內酰胺氮正離子，然后與DNA堿基反應形成加合物[1,7,13]。4種加合物已經在給藥動物和上尿路上皮癌患者的腫瘤組織中被發現[1,7,14]：7-(2′-脫氧腺嘌呤核苷-N6-基)馬兜鈴內酰胺I（7-(2′-deoxyadenosin-N6-yl)aristolactam I，dA-AL I）、7-(2′-脫氧鳥嘌呤核苷-N2-基)馬兜鈴內酰胺I（7-(2′-deoxyguanosin-N2-yl)aristolactam I，dG-AL I）、7-(2′-脫氧腺嘌呤核苷-N6-基)馬兜鈴內酰胺II（7-(2′-deoxyadenosin-N6-yl)aristolactam II，dA-AL II）和7-(2′-脫氧鳥嘌呤核苷-N2-基)馬兜鈴內酰胺II（7-(2′-deoxyguanosin-N2-yl)aristolactam II，dG-AL II）（4 種加合物結構見圖2）。其中dA-AL I 加合物難以修復，能誘導DNA突變，從而可能引起癌癥[1,15]。

在大多數馬兜鈴屬植物中，雖然馬兜鈴酸I 和馬兜鈴酸II 通常是含量最高的主要化合物，但這些植物常常還含有其它馬兜鈴酸化合物。其中1種化合物馬兜鈴酸IVa（圖1）在某些藥用植物中也是1 種主要成分[7,16-19]，特別是在天仙藤中，馬兜鈴酸IVa含量遠遠超過馬兜鈴酸I和馬兜鈴酸II[20]。考慮到馬兜鈴酸IVa與馬兜鈴酸I 的結構差異僅僅是1 個10 位上的羥基（圖1），我們推測馬兜鈴酸IVa也能經歷與馬兜鈴酸I相似的還原活化過程并形成DNA加合物。但是，關于馬兜鈴酸IVa形成DNA加合物的研究還沒有任何報道。因此，作為對此推測的初步探索，本文使用LC-MS/MS研究 了 馬 兜 鈴 酸IVa與2′-脫 氧 腺 嘌 呤 核 苷（2′-deoxyadenosine，dA）或2′-脫 氧 鳥 嘌 呤 核 苷（2′-deoxyguanosine，dG）在溶液中的反應，以中性丟失模式搜索可能的2'-脫氧腺嘌呤核苷和2'-脫氧鳥嘌呤核苷加成產物。

1 試劑與方法

1.1 試劑

馬兜鈴酸IVa從馬兜鈴（A.debilis）提取純化，液相色譜-紫外分析表明其純度為94.6% （檢測波長244 nm）。2'-脫氧腺嘌呤核苷和2'-脫氧鳥嘌呤核苷購于Alfa Aesar 公司（Ward Hill，MA，USA），N,N-二甲基甲酰胺和鋅塵購于Sigma-Aldrich 公司（St. Louis，MO，USA），乙腈（色譜級）購于Fisher Scientific 公司（Waltham，MA，USA），甲酸（色譜級）、鹽酸、二甲亞砜、磷酸二氫鉀和氫氧化鉀購于國藥集團化學試劑有限公司（中國，上海），實驗用水由Millipore 超純水儀制備（Burlington，MA，USA）。

1.2 實驗方法

1.2.1 馬兜鈴酸IVa與2'-脫氧腺嘌呤核苷或2'-脫氧鳥嘌呤核苷的反應

反應參照文獻中馬兜鈴酸I 與2'-脫氧腺嘌呤核苷或2'-脫氧鳥嘌呤核苷的反應條件進行[14]。在多次試驗中，使用了不同的反應物量和反應溫度。以下給出典型的反應示例。

20 mg 鋅塵預先用200 μL 0.2% 鹽酸活化1 h，15,000 g 離心5 min，去掉上清液，加入1 mg 馬兜鈴酸IVa溶于100 μLN,N-二甲基甲酰胺的溶液，再加入2 mg 2'-脫氧腺嘌呤核苷或2'-脫氧鳥嘌呤核苷溶于1 mL pH 5.8磷酸鹽緩沖液的溶液，37℃暗處孵育24 h，冰中冷卻30 min，15,000 g 離心5 min，小心取出上清液，離心濃縮至干，殘余物用40 μL二甲亞砜重溶，LCMS/MS 分析。為提高反應效率，也使用了更高反應溫度（50℃）。

1.2.2 LC-MS/MS分析

LC- MS/MS 分 析 在Agilent 1290 HPLC（Santa Clara，California，USA）和Sciex Triple Quad?4500 質譜儀（Framingham，MA，USA）上用Agilent Poroshell 120 EC-C18（2.1×100 mm，2.7 μm）色譜柱進行。流動相為0.1% （v/v）甲酸（A 相）和含有0.1% （v/v）甲酸的乙腈（B 相）。梯度洗脫由1% 的B 相起始，24 min 時升到49% 并維持1 min，從25到28 min，由49% 降到1% 。流速：300 μL ?min-1，柱溫：40℃。電噴霧離子源，陽離子掃描模式，電壓5500 V，離子源溫度500℃。其它參數設置如下：氣簾氣（curtain gas，CUR），30 psi；噴霧氣（ion source gas 1，GS1），50 psi；輔助加熱氣（ion source gas 2，GS2），50 psi；碰撞氣（collision gas，CAD），8 psi；去簇電壓（declustering potential，DP），60 V；入口電壓（entrance potential，EP），10 V；碰撞室出口電壓（cell exit potential，CXP），7 V；碰撞能量（collision energy，CE）每隔2 s由20變到30再變到40 eV（在質譜一次掃描時間內）。掃描模式：中性丟失，丟失碎片質量數設置為116，掃描范圍m/z200-600 Da，掃描速度200 Da s-1。

高分辨LC-MS/MS 分析在Agilent 1290 HPLC 和Sciex Triple TOF 4600 質譜儀上用Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18（2.1×50 mm，1.8 ?m）進行，流動相為0.1% （v/v）甲酸（A相）和乙腈（B相）。梯度洗脫由10% 的B相起始并維持1 min，6 min時升到95% 再維持3 min，從9 到9.1 min，由95% 降到10% 。流速：400 μL ?min-1，柱溫：25℃。電噴霧離子源，陽離子掃描模式，電壓5000 V，離子源溫度500℃。其它參數設置如下：CUR，35 psi；GS1，50 psi；GS2，50 psi；DP，100 V；CE，40 eV；掃描范圍m/z50-1500 Da。

2 實驗結果

2.1 馬兜鈴酸IVa與2'-脫氧腺嘌呤核苷反應產物分析

根據馬兜鈴酸I 的反應[14]（圖2），預計如果馬兜鈴酸IVa與2'-脫氧腺嘌呤核苷相似地發生反應，則加合物分子式為C27H22N6O8，分子量558。因此，用中性丟失模式（設置中性丟失部分質量數為116）掃描獲得反應混合物總離子流色譜圖，再以m/z559 提取色譜圖，可以看到7個主要的峰，按保留時間增加的順序從A1到A7 依次編號（圖3A）。檢查這些化合物的質譜圖，發現A3、A6 和A7 具有較強m/z559 信號（圖3B，僅展示A3的質譜圖，A6和A7的質譜圖相似），而其余四個化合物只有非常弱的m/z559信號。設定m/z559進行產物離子掃描以檢測這些化合物的碎裂方式，發現A3的主要碎片是m/z443 和308 的2 種離子（圖3C），而A6和A7的主要碎片是m/z443，沒有m/z308。

圖3 （A）馬兜鈴酸IVa與2'-脫氧腺嘌呤核苷在pH 5.8，37℃與鋅塵暗處孵育24 h后，反應混合物用中性丟失掃描（設置中性丟失部分質量數為116），并以預測的可能加合物的質子化分子離子m/z 559提取的色譜圖；（B）圖3A中A3的質譜圖；（C）圖3A中A3的產物離子掃描質譜圖

圖4 （A）馬兜鈴酸IVa與2'-脫氧腺嘌呤核苷反應混合物進行中性丟失掃描獲得的總離子流色譜圖；（B）保留時間16.7 min處產物的質譜圖；（C）該產物的產物離子掃描高分辨質譜圖

圖5 （A）馬兜鈴酸IVa與2'-脫氧鳥嘌呤核苷在pH 5.8，37℃與鋅塵暗處孵育24 h后，反應混合物用中性丟失掃描（設置中性丟失部分質量數為116），并以預測的可能加合物的質子化分子離子m/z 575提取獲得的色譜圖；（B）圖5A中G3的質譜圖；（C）圖5A中G3的產物離子掃描質譜圖

中性丟失掃描的總離子流色譜圖在保留時間16.7 min 處有1 個較高的峰（圖4A，12.3 min 處較小的峰質譜圖上基峰為m/z328，其它峰很弱，故未進一步考察），其質譜圖上幾乎只有1 個m/z573 峰（圖4B）。用產物離子掃描檢測該產物的碎裂方式，發現m/z573母離子在m/z457和322處產生2個很強的峰。將該產物用HPLC 分離后再用高分辨質譜檢測，獲得其母離子精確質量數為573.1714，產生的2 個子離子的精確質量數為457.1253和322.0708（圖4C）。

2.2 馬兜鈴酸IVa與2'-脫氧鳥嘌呤核苷反應產物分析

按照馬兜鈴酸IVa與2'-脫氧腺嘌呤核苷的反應，預計馬兜鈴酸IVa與2'-脫氧鳥嘌呤核苷的加合物分子式為C27H22N6O9，分子量574。馬兜鈴酸IVa與2'-脫氧鳥嘌呤核苷反應混合物用中性丟失模式檢測，并設定m/z575 提取色譜圖，可以看到4 個峰（圖5A），按保留時間增加的順序從G1到G4依次編號。檢查它們的質譜圖，發現4 種產物都有強的m/z575 信號（圖5B 顯示了G3 的質譜圖，其它產物質譜圖相似）。用產物離子掃描模式檢查這些產物母離子的質譜碎裂情況，發現G1、G2 和G3 均產生m/z459 和308 兩種子離子（圖5C顯示了G3 的母離子的碎裂結果），而G4 只產生m/z459子離子。

與馬兜鈴酸IVa和2'-脫氧腺嘌呤核苷反應混合物情況相似，通過中性丟失掃描獲得的總離子流色譜圖上可看見一些較明顯的峰（圖6A）。檢查它們的質譜圖，發現其中3個峰（按保留時間增加的順序依次命名為G5、G6和G7）的質譜圖上有很強的m/z591峰（此峰是這3 個產物質譜圖中的基峰，與圖4B 情況相似）。設置m/z591進行產物離子掃描，G5和G6在m/z475和308處產生2個強的峰，m/z308峰是譜圖中的基峰，其強度約為m/z475信號的2-3倍。但G7的譜圖中則只顯示了m/z475的峰（基峰）。用HPLC分離出少量G5，進行高分辨質譜檢測，獲得其母離子精確質量數為591.1459，產生的2個子離子的精確質量數為475.0936和308.0524（圖6B）。

圖6 （A）馬兜鈴酸IVa與2'-脫氧鳥嘌呤核苷在pH 5.8，50℃與鋅塵暗處孵育24 h后，反應混合物用中性丟失掃描（設置中性丟失部分質量數為116）獲得的總離子流色譜圖，其中3個峰G5、G6和G7的質譜圖顯示了強的m/z 591峰；（B）G5的高分辨質譜圖

3 討論

中性丟失是串聯質譜中的1 種掃描模式，通過設定母離子在質譜碎裂過程中丟失的中性碎片的質量數來篩選化合物[21]。2′-脫氧核苷及其加合物存在著1種共通的質譜碎裂方式，即糖苷鍵斷裂，失去2′-脫氧核糖部分的碎裂方式，其結果是產生M-116 的子離子。因此，可以使用中性丟失模式，設定丟失的質量數為116進行2′-脫氧核苷加合物的篩選[21]。

根據已報道的dA/dG-AL I/II加合物的質譜數據[22]，失去2′-脫氧核糖部分后的離子，在適當的碰撞能量下還可進一步失去堿基。例如，dG-AL II 的質子化分子離子MH+（m/z529）很容易失去2′-脫氧核糖部分，產生m/z413（[MH-116]+）的子離子，在更高的碰撞能量下還可丟失中性的鳥嘌呤堿基（C5H5N5O = 151），產生m/z262（[MH-116-151]+）的子離子[22]。因此，通過中性丟失堿基的情況，可獲得產物結構的進一步信息。

根據上述質譜碎裂方式，本文首先使用中性丟失模式，設置中性丟失的質量數116 并以預計的加合物質子化分子離子m/z559 在馬兜鈴酸IVa與2'-脫氧腺嘌呤核苷的反應混合物中進行篩選，發現7 種可能產物，但其中4 種m/z559 信號過弱，故未進一步考慮。其余3種化合物進行產物離子掃描時均觀察到m/z443峰，即[MH-116]+子離子。其中1種產物（化合物A3）不僅有較強的m/z443信號，還有m/z308信號（圖3C），即[MH-116-135]+子離子，應該是丟失腺嘌呤（C5H5N5=135）引起。依次丟失116和135的中性碎片，說明這3種產物很可能是預期的dA-AL IVa加合物。相似地，在馬兜鈴酸IVa與2'-脫氧鳥嘌呤核苷的反應混合物中篩選到4 種可能的加合物。無論2'-脫氧腺嘌呤核苷還是2'-脫氧鳥嘌呤核苷都形成多個可能的加合物，可能是由于2'-脫氧腺嘌呤核苷和2'-脫氧鳥嘌呤核苷上有多個反應位點的緣故。

有趣的是，除了上述預期的“常規”加合物外，在2'-脫氧腺嘌呤核苷或2'-脫氧鳥嘌呤核苷的反應混合物中，都發現了非“常規”的可能加合物。在馬兜鈴酸IVa與2'-脫氧腺嘌呤核苷反應混合物中，發現了1 種分子量為572 的可能加合物，其分子量較“常規”加合物大14，可能意味著含有1 個額外的N 原子或CH2，相應的分子式為C27H22N7O8或C28H24N6O8，其質子化分子離子的精確理論質量數分別為573.1608 或573.1734。高分辨質譜顯示該產物質子化分子離子的精確質量數是573.1714，顯然說明后者是正確的。因此，該產物應該含有1 個額外的CH2而不是N 原子。由于該產物的質譜碎裂方式是依次失去2′-脫氧核糖和腺嘌呤堿基，表明這個額外的CH2位于馬兜鈴酸環系上。失去2′-脫氧核糖和腺嘌呤堿基后的離子的化學式分別是C23H17N6O5和C18H12NO5，相應的質量數分別為457.1260和322.0715，與實測值457.1253 和322.0708 符合得非常好，也證明了上述結構推測的合理性。

而在馬兜鈴酸IVa與2'-脫氧鳥嘌呤核苷的反應混合物中，則發現了3種分子量590的可能加合物，其中1 種通過高分辨質譜進行了驗證。由于分子量較“常規”加合物大16，說明這些加合物分子中具有1個額外的O 原子或NH2，相應的分子式為C27H22N6O10或C27H24N7O9，其質子化分子離子的精確理論質量數分別為591.1476或591.1714。高分辨質譜測得的實際精確質量數是591.1459，說明前者是正確的，即該產物分子中較“常規”的加合物多1個O原子。高分辨質譜結果顯示該產物母離子依次丟失2′-脫氧核糖和1 個質量數167.0412 的碎片；由于鳥嘌呤堿基的質量數是151.0494，如果含有1 個額外的O 原子，則質量數變為167.0443，這表明這個額外的O 原子很可能位于鳥嘌呤堿基環系上。按此推測，丟失2′-脫氧核糖和含有1個額外O 原子的鳥嘌呤堿基后，所獲得的離子的化學式應該分別為C22H15N6O7和C17H10NO5，相應的質量數分別 為475.1002 和308.0559，與 實 測 值475.0936 和308.0524 符合較好，說明對此化合物結構的推測是合理的。

質譜本身只能提供化合物分子式的信息。對于已知化合物，可以通過譜圖數據庫搜索或與文獻報道數據比較從而確定化合物的結構；而對于未報道的化合物，只能通過分析質譜碎裂過程推測其結構，但推測的結構通常不能作為確定的證據。因此，本文結果僅僅表明在體外特定條件下（pH 5.8 溶液中以鋅作為化學還原劑），馬兜鈴酸IVa與2'-脫氧腺嘌呤核苷和2'-脫氧鳥嘌呤核苷可發生反應形成若干種可能的加合物。由于這些可能的加合物的結構尚不能確定，且反應是在非生理條件下獲得的，因此馬兜鈴酸IVa是否能形成DNA 加合物，尤其是在活體內形成DNA 加合物，仍然是不清楚的。這些是下一步實驗將要解決的問題。同時，本實驗室正在進行馬兜鈴酸IVa與2'-脫氧腺嘌呤核苷和2'-脫氧鳥嘌呤核苷形成的可能加合物的分離和純化，以獲得足夠的量通過核磁共振光譜確定結構，并為未來的體內實驗提供標準樣品和建立相應的分析方法。