馬兜鈴酸致癌作用的分子毒理學關鍵點

馬 紅，黃 超，王方園，王亦男，劉淑清，楊 凌

（1.上海中醫藥大學系統藥物代謝動力學中心 上海 201203；2.上海市針灸經絡研究所 上海 200030；3.大連醫科大學基礎醫學院 大連 116044）

1 致癌物評價基于對其固有特性的評價

1.1 馬兜鈴酸為何被確定為致癌物？

1.1.1 致癌物定義

致癌物是指可誘發或增加癌癥發生率的化學物質或化學混合物，這是化合物的固有特性，因此，只要能反映出其固有特性，并依據固有特性產生的評價方式都可以作為衡量手段。這里需要指出其中包括了兩個重要含義：①除非有明確的機理證據表明所引發的良惡性腫瘤在種屬間有明顯差異性重要事件或決定性事件，否則在動物中所發生致癌結果同樣會發生于人體，也即動物致癌物也被視為或假設為人體致癌物；②致癌物的定義中涉及的第2個含義是指致癌物性質只取決于其物質的內在本性，不需要提供其在具體使用環節中致人體致癌風險的劑量及其環境相關信息[1,2]。

國際癌癥研究機構，從1971年起組織專家組收集和評價世界各國有關化學物質對人類致癌危險性的資料，編輯出版《IARC 關于化學物質致人類癌癥危險性評價專題論文集》，并于1979 年、1982 年和1987 年3次組織專家組對上述專題論文集所評價的環境因子和類別、混合物及暴露環境對人類的致癌性進行再評價，并出版報告。自1987 年專題論文集改名為《IARC 關于致人類癌癥危險性評價專題論文集》，并擴展到物理因子、生物因子致人類癌癥危險性評價。IARC 關于化學物質致人類癌癥危險性分類只與一種化學物致癌性證據的充分性（證據權重）有關，而并不涉及其致癌活性大小及其機制[3]。

1.1.2 致癌物評價標準

國際上根據以下10條證據性事件（主要是分子毒理學證據）來分類、歸屬與定義致癌物：①本身或被代謝激活后是否產生親電性；②是否產生基因毒；③是否改變基因修復或引發基因組不穩定性；？④是否誘發表觀遺傳學改變；⑤是否導致氧化應激作用；⑥是否誘發慢性炎癥反應；⑦是否產生免疫抑制；⑧是否產生受體介導的調控效應？⑨是否導致細胞永生化？⑩是否改變細胞增殖、細胞死亡或營養供給？綜上所述，致癌物評價標準關注的是致癌機制中最關鍵性、轉折性事件，羅列于此的標準性事件可以通過不同方法與模型來實現。這些標準決定了分子毒理學的評價程序、信息收集與框架匯總，也是現行“3R”毒理學評判準則的依據。該標準中，需要把最基本或最重大的要素與事件從致癌過程與機制中模式化地提煉出來，模型中的關鍵要素，再綜合考慮到具體測定方法的靈敏性、精確性、穩定性等，制訂相應的評價方法與準則。因此，具體的評價方法是否用體內或體外方法，則完全取決于能否實施上述原則。

表1 致癌物的分子毒理學事件[2-4]

如表1所示，馬兜鈴酸作為致癌物的重要特征：①有明確致人體癌癥的流行病學證據；②有親電加合物形成的鐵證；③有明確的突變標識特征（Mutational Signature）：“A:T→T:A顛換突變”。無論是加合物或是上述突變標識特征均可在體內外標本中發現。依據以上定義與分類原則，馬兜鈴酸被確認為致癌物。它還會引起人類癌癥，所以被確認為“一級致癌物”[2,3]。

1.1.3 致癌物評價標準與機理研究的區別

在上述致癌物評價準則中，致癌過程和機制當然非常關鍵，但與致癌物標準不同的是具體致癌機制與過程取決于具體的模型對象，與模型的種屬、個體、代謝能力、DNA修復過程等相關。研究對象不一定是標準化、模式化的，但可具有以上機制的代表性，這要根據機制研究強調的重點以及研究興趣點而決定的。

1.1.4 加合物產生機制[5]

人類經常接觸的各種環境、飲食中基因毒物性物質及內源性的親電物質，這些活性物質可以破壞DNA并形成共價修飾，即產生DNA加合物。在腫瘤相關基因的關鍵位點上形成的DNA 加合物被認為是化學致癌作用的第一步。許多致癌物質在與DNA 共價結合之前需經代謝活化以形成反應中間體。這些代謝活化反應由體內代謝酶（I 相和II 相代謝酶）催化產生。這些活性反應中間體進一步與DNA上的堿基、磷酸基團或者脫氧核糖上的相關位點結合。而這種結合反應包括多種類型，即反應中間體可通過烷基化、雙親電子交聯以及通過與脂質過氧化或自由基反應形成DNA 加合物。DNA 加合物的類型取決于反應性化學物質的結構、親電性物質的性質以及反應中間體與DNA嵌入的能力，決定加合物與哪些DNA堿基的上親核位點結合。加合物形成可發生在DNA的多個親核位點，包括鳥嘌呤和腺嘌呤的C8原子、核堿基的環上和環外N和O 原子及胞嘧啶C5-甲基的氧化。其中，胞嘧啶C5 甲基的氧化是表觀遺傳學的重要標志。鳥嘌呤C8 原子氧化產生的7,8-二氫-8-氧鳥嘌呤(8-oxo-Gua)和2,6-二氨基-4-羥基-5-甲酰胺基(Fapy-Gua) 分別是氧化應激和基因毒性病變標志物。

1.1.5 堿基對替換突變特征與突變機制[6]

堿基替換是指基因組中堿基對被另一堿基對替換的現象。根據體細胞堿基置換方式，堿基對突變共有六種方式：C?G→A?T，C?G→G?C，C?G→T?A，T?A→A?T，T?A→C?G 以及T?A→G?C。可用于相對粗曠分析以及腫瘤類型或者外源性致癌物類型的分類[7]。馬兜鈴酸的主要堿基對替換特征是T?A→A?T 顛換[8]。此外，突變位置的側翼序列以及突變堿基對相鄰位置的堿基種類也影響突變率。堿基替換突變發生在DNA 損傷及修復或者DNA 復制的過程中。每種DNA損傷機制均有其相應的堿基偏好，從而形成特征性的突變模式。每一種特定的突變特征實質上都代表著不同的基因突變機理。因此，突變類型可以被視為致癌物的固有或內在特征。

上述的突變特征說明的是致癌物的固有特征。在機理研究中，則要說明這些特征意味著什么？例如，內源性DNA 損傷引起的突變模式與堿基的脫氨基反應有關。常見的脫胺反應包括5-甲基胞嘧啶→胸腺嘧啶、胞嘧啶→尿嘧啶、腺嘌呤→次黃嘌呤反應。如甲基化CpGs是基因組中突變率最高的位點之一，同時也是C·G→T·A突變模式的主要影響因素。與這一現象相一致的是NpCpG位點的C·G→T·A突變是兩個最常見的突變模式1A 和1B的特征，其在至少25種不同的癌癥類型均有發現[7]。外源性的物理或化學因素也可導致DNA損傷，如非電離的紫外輻射能導致相鄰的嘧啶核苷酸的共價修飾。這種修飾形成了嘧啶二聚體：嘧啶光產物及環丁烷嘧啶二聚體（CPDs）。與紫外線照射有關的皮膚癌（例如鱗狀細胞皮膚癌和惡性黑色素瘤）中也多見雙嘧啶堿基位點的C·G→T·A 突變或是CC·GG→TT·AA突變。

DNA修復過程中也能導致DNA損傷，如堿基切除修復（BER）中，當DNA糖基化酶識別損傷位點后會水解裂解和移除改變的堿基，從而產生無尿或無嘧啶位點。未修復的無尿或無嘧啶位點在復制過程中很容易引入錯誤的堿基，從而引起突變。核苷酸切除修復（NER）是一種非特異性的修復過程，當檢測到大量的DNA 畸變時，例如苯并芘（BaP）和黃曲霉毒素等芳香胺引起的大量加合物以及鉑類化合物、補骨脂素和UV誘導的損傷等，都會激活這種修復過程。轉錄偶聯修復是典型的DNA修復類型，這種修復機制將導致轉錄鏈上的DNA損傷修復效率比非轉錄鏈更高。因此，在某些突變模式中出現轉錄鏈差異。復制后錯配修復（MMR）系統可以識別和修復錯誤的堿基，以及在DNA復制和DNA重組修復活動中出現的錯誤。因此，MMR通路的缺陷增加了自發突變率，MMR相關蛋白的突變則影響基因組的穩定性并導致微衛星DNA 不穩定性增加。雖然NMR 相關的堿基突變特征目前還沒有確切研究，但是在原發性癌癥中發現NpCpG位點處的C·G→T·A以及CpCpC位點處的C·G→A·T均與MMR缺失相關。除此之外，MMR基因缺陷相關的癌癥中出現大量的1-bp 插入突變，這一突變引起微衛星DNA 不穩定性。由于人類基因組非常龐大，DNA合成過程中即使很低的錯誤率也會導致大量的突變，使得DNA復制錯誤也是突變產生的機制之一。高保真度B族DNA聚合酶Polδ和Pol ε由于具有校對功能，其每個堿基的合成錯誤率在1/107。體細胞和生殖細胞中Polε的突變與結直腸癌和子宮內膜癌有關的突變特征10相關，顯著表現為TpCpG 位點的C·G→A·T和C·G→T·A突變。另一導致復制過程中堿基錯配的因素是細胞中三磷酸脫氧核苷酸含量的失衡。在癌癥發展過程中，細胞周期調控失常導致對dNTP的需求增加。dNTP儲備的失衡可能導致插入-切除循環、堿基錯配以及校對效率，從而產生突變。

通過對9T 腫瘤中基因組序列的267192 個A-T 替換位點發現，突變腺嘌呤核苷酸位點兩側胞嘧啶核苷酸、胸腺嘧啶核苷酸（即突變位點為C|T]A）以及鳥嘌呤核苷酸（突變位點為AG）高表達。與此一致的是，在16種可能的A-T突變三核苷酸組合中，馬兜鈴酸引起的TAG和CAG最為常見。除了側翼序列（即+/-1）之外，位于+/-2位點的核苷酸也可能影響馬兜鈴酸的突變選擇性。例如C|TAG序列特征在其他非馬兜鈴酸引起的腫瘤中并未發現，說明其是馬兜鈴酸引起的突變的特異性特征。研究發現在馬兜鈴酸引起的A-T突變位點（TA 及CA）中5′端+2 位腺嘌呤核苷酸高表達（即ATA 及ACA）3′端-2 位以鳥嘌呤核苷酸常見（即AGG）。因此，馬兜鈴酸引起的A-T突變的主要序列特征為A[C|T]AGG，這一特征也在AA-UTUC外顯子中得以驗證[8]。目前認為馬兜鈴酸引起的T?A→A?T 顛換與DNA復制過程相關，同時這一突變具有轉錄鏈偏差效應，即轉錄鏈出現的突變率相較非轉錄鏈要低，這是由于DNA的轉錄偶聯修復機制，這種修復機制導致轉錄鏈上的DNA損傷修復效率比非轉錄鏈更高[7,8]。

2 突變與致癌過程

腫瘤發生與發展基于遺傳信息突變的。在正常情況下，這些突變在組織中也會發生，并在組織間與物種間變化與傳遞。當細胞分裂期間發生自發遺傳過程的錯誤時，其內部許多修復機制與系統可以進行校正，足以應對這樣的突變頻率。只有當損害持續并且到達產生腫瘤的閾值點才會導致腫瘤的發生。從這個意義上講，人類的腫瘤或癌癥可視為一種遺傳性疾病。

2.1 致癌過程

腫瘤發生是多因素或多病因、多步驟、多年份、多基因和多途徑的，也即多特征的。化學致癌作用步驟至少涉及三個重大步驟：“觸發”、“啟動”和“進展”（圖1）。傳統上只用形態學特征來表征，但在觸發階段，分子毒理學水平的評價更為敏感和重要。

圖1 化學致癌作用過程的關鍵步驟

圖2 AAs-DNA加合物的結構

顯然，馬兜鈴酸類化合物（AAs）進入體內，經過活化產毒，生成相應的活性中間體，與DNA 反應形成加合物，DNA 加合物有多種結構，代謝活化的AAs 與DNA 中嘌呤堿基的環外氨基形成AAs-DNA 加合物，如dA-AAI、dG-AAI、dA-AAII、dG-AAII（圖2）。DNA加合物聚集導致堿基突變，具體如AAI，先通過硝基還原反應和環化反應，將其轉化為N-羥基馬兜鈴酸（AL-NOHs）。然后形成具有非定域正電荷的親電性的環氮鎓離子中間態。中間態優先結合DNA 中嘌呤堿基的環外氨基形成AAI-DNA 加合物，分別為dAAAI和dG-AAI，可促進基因腺嘌呤（A）與胸腺嘧啶（T）的突變轉換，即AT→TA，如果受損傷的DNA未被完全修復或修復發生錯誤，會發生DNA 突變，DNA 突變如果被放大到一定水平，使腫瘤抑基因TP53突變失去正常功能，從而使細胞增殖增強、分化異常，最終導致腫瘤的發生。TP53突變和AAs代謝產物-DNA加合物的形成被認為是一個階段性標志，相應的指標也就成為評估AAs暴露及突變特征的生物標志物。在上述過程中，醌氧化還原酶（NQOI）在肝和腎的AAs代謝活化中起著非常重要的作用，催化AAI 產生還原性環氮鎓離子[9]。環加氧酶（COX）也能催化AAI-DNA加合物的形成。馬兜鈴酸I（AAI）和馬兜鈴酸II（AAII）是主要毒性成分。以AAI 為例，AAs 致癌過程的關鍵步驟的差異主要涉及到生物轉化過程的參與。該生化過程包括AAI的活化、AAI-DNA加合物生成、DNA多位點突變。

2.2 肝臟代謝與轉運功能對AAs致癌作用的影響

2.2.1 總體暴露與一般規律

盡管近來有報道說AAs說可以造成人體肝癌[10,11]，但總體上，大量的流行病學證據表明，馬兜鈴酸的主要靶向組織器官被公認為泌尿系統（表2）。馬兜鈴酸在體內暴露并非均一，腎臟有明顯的富集作用[12]。經口服途徑暴露后，腎臟中的檢出暴露量是肝臟以及其它組織的兩倍以上。

表2 暴露于馬兜鈴酸（AA）個體的腎組織中DNA加合物（dA-AAI）水平

如圖3 所示，代謝活化是主要化學誘變致癌的機制。在肝細胞、腎細胞、腸細胞等的平滑內質網中富含細胞色素P450 單加氧酶系（Ⅰ相代謝酶系）。這些細胞色素P450單加氧酶將活性、極性基團引入致癌物的結構中，活化了致癌物，生成具有強親電性質的物質，從而引發DNA 加合物的形成。II 期反應由肝內和肝外內質網中的UGT、SULT、COMT 等將強親水性基團結合覆蓋于活化的官能基團上，將降低毒性，增加水溶性，經過體內轉運體作用，再經尿液、膽汁等排出體外。對于II 相酶活性較低的人群（如兒童、老年人，或者因疾病、遺傳、飲食或種族等因素所致II相酶活性降低）[13],致癌物的高暴露風險將會增加（圖4）。

馬兜鈴酸的代謝表現出很大的個體差異，也就是并非所有暴露個體均會產生致癌作用。由于AAI 是AAs 中主要致癌物質，比較傾向性的是AAI 代謝催化酶的高低是引發個體敏感性差異的原因之一。與上述一般機制一樣，主導AAs 毒性活化的催化代謝酶被認為是NQOI 和COX[14]。比較有爭議的是肝臟CYP 還原酶（CRP）與P4501A（1A1與1A2）的催化作用。

圖3 AAs的生物活化和DNA加合物形成的途徑

圖4 基因毒和非基因毒性事件對致癌過程

2.2.2 AAs代謝作用的爭議

早期的體外研究認為，AAI在經肝臟CYP1A1/2去甲基化的過程是毒性激活過程，但近期體內外研究已經基本確立肝臟CYP1A1/2 去甲基化的過程是AAI 的解毒過程。如使用肝臟CYP 還原酶缺失（Hepatic cytochrome P450 (Cyp) Reductase Null，HRN）小鼠（其中，肝細胞中NADPH 依賴性Cyp 氧還酶被敲出）、Cyp1a1((-/-))、Cyp1a2((-/-))兩個單敲出小鼠、Cyp1a1/1a2((-/-))雙敲出小鼠[15]、以及人源性CYP1A導入小鼠，這些研究最終證實小鼠與人肝CYP1A（包括1A1 與1A2）是解毒作用，而CRP 仍然是毒性激活作用。另外，肝臟還有另一種毒方式，通過II相代謝將AAs磺酸化，再通過MRP 的協同外排作用，減小肝內暴露。這些可以解釋為何肝臟開始接觸AAs量較腎臟如此之大卻能夠幸免于難。

2.2.3 轉運體的作用[16]

轉運體的影響不可小視，至少涉及到肝腎兩個臟器的轉運體。比較粗放的研究結論說，AAI 經過磺酸化作用被MRP 排至血液、轉運至腎臟，由腎臟OAT 攝入而富集于腎臟與腎小管內從而造成腎臟的高暴露。這里有兩個重要問題，被磺酸化后的AAI 結合物其DNA 結合作用到底是否減低？是磺酸化結合物分解后造成高暴露？兩個臟器都是富含轉運體的臟器，但這些轉運體，但還有哪些轉運體參與了這個轉運或者富集或者排泄過程？一般想定是轉運體間的微妙差異會決定兩者不同的暴露及最終命運？但這個作用到底有多么重要。這個方面的研究還相當欠缺，其中沒有好的同時導入多轉運體的活體模型是一個關鍵或重要原因。

近期國內許多研究團隊證明在幼鼠中可以誘導出肝癌[10,11]，但在成年鼠中比較難以獲得致癌結局。作者斗膽猜測與幼鼠的CYP活性過低、磺酸化酶與轉運體等發育不全有關。當然，作者建議，如再次進行相關研究時，需要嚴密監控相關代謝與轉運機制或有意設計相關模型來證實和排除作者的猜測。這個領域的研究對幫助我國學者樹立本學科的前沿與領先地位可能帶來機遇。

3 總結

馬兜鈴酸是一級致癌物，對于其評判分類與標準沒有爭議，主要學術爭論可能產生于外源性代謝與轉運在其致癌作用進程及其致癌機制中的作用。此案評價是一個很好的范例，能夠幫助我們充分理解分子毒理學的國際研究規范，使我國相關的研究提升到一個新的水平。